Counting proteiner i enkelt celler med adresserbare Droplet Microarrays
Summary
Her præsenterer vi adresserbare droplet microarrays (Søren Peter), en droplet array baseret metode kan afgøre absolutte protein overflod i enkelte celler. Vi demonstrere evne til Søren Peter at karakterisere heterogenitet i udtryk for tumor suppressor protein p53 i en menneskelige cancer cellelinie.
Abstract
Ofte cellulære adfærd og cellulære svar der analyseres på befolkningsniveau hvor svar af mange celler er samlet sammen som en Gennemsnitsresultat maskering rige enkelt celle adfærd inden for en kompleks befolkning. Enkelt celle protein påvisning og kvantificering teknologier har gjort en bemærkelsesværdig indvirkning i de seneste år. Her beskriver vi et praktisk og fleksibel enkelt celle analyse platform baseret på adresserbare droplet microarrays. Denne undersøgelse beskriver hvordan de absolutte kopi numre af target proteiner kan måles med en enkelt celle opløsning. Tumor suppressor p53 er de mest almindeligt muterede gen i menneskelige kræft, med mere end 50% af samlede kræfttilfælde udviser en ikke-sund p53 udtryk mønster. Protokollen beskriver trin for at oprette 10 nL droplets for enkelt menneskelige kræftceller er isoleret og eksemplarnummer p53 protein er målt med enkelt molekyle opløsning til netop afgøre variationen i udtrykket. Metoden kan anvendes til enhver celletype herunder kildemateriale til at bestemme det absolutte kopi antal enhver target proteiner af interesse.
Introduction
Målet med denne metode er at bestemme variationen i overflod af en target protein i en celle population med enkelt celle opløsning. Enkelt celle analyse giver en række fordele, som ikke er tilgængelige med traditionel ensemble biokemiske metoder. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 for det første, arbejde på de enkelt celle niveau kan fange de rige heterogenitet af en celle befolkning, som ellers ville være tabt af det gennemsnit, der opstår med traditionelle ensemble biokemiske teknikker. Størstedelen af arbejdet-hest biokemiske metoder arbejde med bulk, kræver, som de ofte gør, millioner af celler til at producere et resultat. Selvfølgelig, konsekvenserne af vurderingen af hele cellepopulationer afhænger af en række faktorer, eksempelvis heterogenitet i protein udtryk hvor nogle vigtige funktioner i fordelingen af protein overflod kan blive savnet. Fra et praktisk perspektiv, den følsomhed, der kræves af enkelt celle teknikker gør dem i stand til at arbejde med mængder af biologisk materiale, der er utilstrækkelig til selv de mere følsomme bulk teknikker til at fungere. Et vigtigt eksempel på dette er studiet af sjældne celletyper såsom cirkulerende tumorceller (CTCs) hvor selv for patienter med en dårlig prognostiske outlook mindre end 10 CTCs kan være til stede i en enkelt 7,5 mL blod tegne. 6 her præsenterer vi den metode, der kræves for at udføre enkelt celle protein målinger ved hjælp af en reduceret mængde antistof-baseret analyse beskæftiger olie-udjævnede dråber trykt på et antistof microarray.
Mikrofluid dråbe platforme er høj overførselshastighed, stand til at generere tusindvis af dråber per andet og i stand til at isolere, og endda dyrkning, enkelt celler i enkelte dråber til at udføre en bred vifte af biokemiske assays. Droplet-baserede teknikker er velegnet til enkelt celle analyse,7,8,9 med bemærkelsesværdige seneste eksempler herunder DropSeq10 og inDrop11, som har været stærkt hjulpet af magt forstærkning teknikker. Den begrænsede mængde af materiale og ingen metoder til forstærkning af proteiner gør enkelt celle proteomics især udfordrende.
Dråberne kan analyseres ved en række metoder og Fluorescens mikroskopi har været meget udbredt. Enkelt molekyle teknikker som total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi tillader fluorescerende molekyler til visualiseres med enestående signal / støj-forhold. 12 på grund af den eksponentiel henfald af feltet flygtige, kun fluorophores i høje nærhed til overfladen (rækkefølgen af 100nm) er glade for at gøre JOHANNAS en god strategi til at opdage små mængder af et target molekyle i en kompleks blanding. Den iboende optiske skære styrke af JOHANNAS også hjælper til at undgå wash skridt og grænserne assay tidsforbruget og kompleksiteten. Men JOHANNAS kræver plane overflader og eksempler på JOHANNAS mikroskopi anvendes til dråber i flow involverer dannelsen af en planar overflade som på billedet. 13 herpå enkelt celle proteom teknikker ofte design mikrofluid chips omkring overflade-immobiliseret capture agenter i en microarray format. 4 , 14
Dråber, selv, kan dannes i arrays på plane overflader, såkaldte droplet microarrays. 15 , 16 , 17 rumligt organisere dråber i arrays tillader dem at være bekvemt indekseret, let overvåges over tid, individuelt rettet og, om nødvendigt hentes. Droplet microarrays kan opnå en høj tæthed af mikro-reaktorer med tusindvis af elementer pr. chip, som er enten fritstående eller understøttet af microwell strukturer. 18 , 19 , 20 de kan være dannet af sekventielle deposition af flydende håndtering robotter, inkjet spottere, kontakt microarrayers21,22,23,24,25, 26 , eller de kan selv samle på overflader som superhydrophillic steder mønstret på en superhydrophobic overflade. 27 , 28 , 29
Med disse overvejelser i tankerne, var adresserbare Droplet Microarrays (Søren Peter) designet til at kombinere alsidighed, rumlige adresserbarhed og reducerede mængder af droplet microarrays med følsomheden af enkelt molekyle JOHANNAS mikroskopi til kvantitativt måle protein overflod. 5 Søren Peter aktiverer enkelt celle analyse danner en droplet microarray med enkelt celler over et antistof microarray, som er så udjævnet med olie til at forhindre fordampning. Mængderne af dråberne er diskret at forhindre tab af prøven, der ellers ville være opnået ved-chip ventilfunktionen i kontinuerlig flow mikrofluidik. 30 det absolutte antal mål protein fra en enkelt celle er ekstremt lille; dog reduceret mængden af dråber giver mulighed for forholdsvis høj lokal koncentration, således at de er opdaget ved hjælp af en sandwich antistof assay – antistof er immobiliseret i et særskilt område, eller spot, på en overflade, som indfanger protein som igen binder til en fluorescently mærket påvisning antistof i droplet volumen. En label-fri tilgang (dvs protein mål ikke skal mærkes direkte), Søren Peter er generelt anvendes til at analysere celler fra primære kilder, såsom forarbejdede blod, fint har brug for aspirates samt dissocierede tumor biopsier og celler fra kultur og deres lysates.
Måle variationen i protein overflod på tværs af en celle population er vigtigt ved fastsættelsen heterogenitet i svar, for eksempel, at et lægemiddel og vil hjælpe med at give indsigt i cellulære funktioner og veje, vurdering af delpopulationer og deres adfærd samt identificere sjældne hændelser, der ellers ville være maskeret af bulk metoder. Denne protokol beskriver, hvordan at producere og anvende adresserbare droplet microarrays fastlægges kvantitativt overflod af transskription faktor p53 i menneskelige kræftceller og kan bruges til at undersøge rollen af p53 svar på kemoterapeutiske stoffer. Target proteinet bestemmes af valget af opsamling og registrering af antistoffer og kan ændres til at omfatte flere eller forskellige mål. Anvisninger til at bygge et simpelt apparat indarbejde en koncentrisk dyse fra generelle lab forbrugsvarer til manuelt array 10 nL dråber udjævnede med olie. Den fulde eksperimenterende proces er beskrevet hvor hver dråbe der derefter indlæses med en enkelt celle, som er så mængden og udtryk for protein bestemmes med enkelt molekyle opløsning ved hjælp af JOHANNAS mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adresserbare Droplet Microarrays er en følsom og extensible metode til kvantitativ bestemmelse af absolut kopi antallet af protein i en enkelt celle.
Begrænsning af niveauet af ikke-specifik binding er (NSB) kritiske i protokollen til at opnå så lav en grænse på opdagelse som muligt. Proteiner og andre biokemiske arter kan ikke-specifikt bindes til en række grænseflader til stede inden for dråberne — coverslip overflade, antistof spot og olie/vand-grænseflade. Proteiner kan gå tab…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR designet eksperimenter, udviklede protokoller og analyseret data. SC og PS udførte celle størrelse eksperimenter. ASR og OC skrev manuskriptet. Forfatterne ønsker at taknemmeligt anerkender støtte fra Prof. David R. Klug for at give adgang til udstyr. Forfatterne vil gerne takke den Imperial College avanceret Hackspace for adgang til fabrikation og prototyping faciliteter.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
Riferimenti
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. “One cell-one well”: A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip – Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
- Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA – Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
