ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים
Summary
כאן אנו מציגים מיקרו droplet למיעון-מערכים (עיוותים), שיטה מערך מבוסס droplet מסוגל לקבוע חלבון מוחלטת שפע תאים בודדים. נדגים את היכולת של ארכיון דיגיטלי כדי לאפיין את הטרוגניות בביטוי של p53 חלבון משתיק קול גידול בקו תאים סרטניים אנושיים.
Abstract
לעיתים קרובות הסלולר התנהגות ותגובות הסלולר מנותחים ברמת האוכלוסייה שם התגובות של תאים רבים הם איחדו יחד בתור תוצאה הממוצע מטשטשים את אופן הפעולה של תא בודד עשיר בתוך אוכלוסיה מורכבת. טכנולוגיות זיהוי, כימות של חלבון תא בודד הפכו את השפעה מדהימה בשנים האחרונות. כאן נתאר פלטפורמה ניתוח תא בודד פרקטי ומודולרי המבוסס על מיקרו-מערכים למיעון droplet. מחקר זה מתאר כיצד ניתן למדוד את המספרים העתקה מוחלטת של חלבונים היעד ברזולוציה של תא בודד. P53 משתיק קול גידול הוא גן שעבר מוטציה הנפוצות ב סרטן אנושי, עם יותר מ- 50% של מקרי סרטן הכולל מפגין דפוס ביטוי p53 שאינם בריאים. הפרוטוקול מתאר את השלבים ליצירת 10 טיפות nL שבתוכו תאים סרטניים אנושיים יחיד מבודדים, המספר עותק של החלבון p53 נמדדת ברזולוציה של מולקולה בודדת כדי לקבוע במדויק ההשתנות בביטוי. ניתן להחיל את השיטה לכל סוג התא כולל חומר ראשוני כדי לקבוע את המספר המוחלט עותק של חלבונים היעד בכל עניין.
Introduction
המטרה של שיטה זו היא לקבוע את הווריאציה בשפע של חלבון המטרה באוכלוסיה תא ברזולוציה של תא בודד. ניתוח תא בודד מספק מספר יתרונות שאינם זמינים עם שיטות ביוכימיות הרכב המסורתי. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . ראשית, עבודה ברמה תא בודד יכול ללכוד את הטרוגניות עשיר של אוכלוסיית תאים אחרת אהיה אבודה על ידי חישוב ממוצע המתרחשת עם טכניקות הביוכימי הרכב המסורתי. רוב שיטות ביוכימיות סוס עבודה לעבוד עם הנפח, המחייב, כמו שעושים בדרך כלל, מיליוני תאים כדי לקבל תוצאה. כמובן, ההשלכות של הערכת אוכלוסיות התא כולו תלוי במספר גורמים, לדוגמה, את הטרוגניות בביטוי חלבונים בו כמה תכונות חשובות של ההתפלגות של חלבון שפע עשויים לפספס. מנקודת מבט מעשית, הרגישות הדרושה של תא בודד טכניקות להפוך אותם מסוגלים לעבוד עם כמויות של חומר ביולוגי אינו מספיק אפילו טכניקות בכמות גדולה יותר רגיש לתפקד. דוגמה מפתח היא המחקר של סוגי תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs) שבו גם עבור חולים עם השקפה prognostic מסכן פחות מ 10 CTCs עשוי להיות נוכח דם בודדת 7.5 mL לצייר. 6 . נציג המתודולוגיה הדרושים לביצוע מדידות חלבון תא בודד באמצעות אמצעי אחסון מופחת נוגדן מבוססי assay העסקת טיפות שמן הכתיר מודפס על microarray נוגדן.
Microfluidic droplet פלטפורמות הם תפוקה גבוהה, מסוגל לייצר אלפי טיפות לכל השנייה, יכולת אנליטית, אפילו culturing, תאים בודדים טיפות בודדות כדי לבצע מגוון רחב של מבחני הביוכימי. טכניקות מבוססות droplet מתאימים היטב לניתוח תא בודד,7,8,,9 , עם דוגמאות הבולטים האחרונים כולל DropSeq10 ו- inDrop11, אשר יש בגילויים באופן משמעותי בכוח טכניקות הגברה. את כמות מוגבלת של חומר ושיטות אין של הגברה חלבונים להפוך לתא בודד פרוטאומיקס מאתגר במיוחד.
טיפות עשוי להיות מנותח על ידי מספר שיטות, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות כבר בשימוש נרחב. מולקולה בודדת טכניקות כגון מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF) מאפשר מולקולות פלורסנט, ניתן לאבחן עם יחס אות לרעש ללא תחרות. 12 עקב דעיכה מעריכית השדה evanescent, רק fluorophores בסמיכות גבוהה על פני השטח (סדר 100nm) נרגשים ביצוע TIRF אסטרטגיה טובה מזהה כמויות קטנות של מולקולה היעד תערובת מורכבת. החוזק הפנימי אופטים אופטי של TIRF גם מסייעת להימנע שטיפת מדרגות, וזמינותו מגבלות הזמן והמורכבות. עם זאת, TIRF דורש משטחים מישוריים, דוגמאות של מיקרוסקופ TIRF חלה על טיפות בזרימת לערב היווצרות של משטח מישורי אשר לתמונה. 13 למטרה זו, תא בודד פרוטיאומיה מבנית טכניקות לעיתים קרובות עיצוב microfluidic צ’יפס סביב סוכני השטח. מרותק למיטה לכידה בפורמט microarray. 4 , 14
טיפות, עצמם, עשוי להיווצר מערכים על משטחים מישוריים, מיקרו-מערכים droplet כביכול. 15 , 16 , 17 במרחב ארגון טיפות לתוך מערכי מאפשר להם להיות נוח ליצור אינדקס, בקלות במעקב לאורך זמן, באופן אינדיבידואלי התייחס ולאחזר, במידת הצורך. מיקרו-מערכים droplet ניתן להשיג צפיפות גבוהה של מיקרו-כורים עם אלפי רכיבים לכל שבב שעמד חופשי או נתמך על-ידי microwell מבנים. 18 , 19 , 20 . הם עשויים להיווצר על ידי התצהיר רציפים ע י טיפול בנוזלים רובוטים, הזרקת דיו יבחינו פנה microarrayers21,22,23,24,25, 26 , או שהם יכולים להרכיב עצמית על משטחים כגון superhydrophillic כתמים בדוגמת על משטח superhydrophobic. 27 , 28 , 29
עם שיקולים אלה בחשבון, Droplet למיעון מיקרו-מערכים (עיוותים) תוכננו כדי לשלב את צדדיות, מיעון המרחבי ואמצעי אחסון מופחת של מיקרו-מערכים droplet עם הרגישות של מולקולה בודדת מיקרוסקופ TIRF כדי באופן כמותי למדוד חלבון שפע. 5 ארכיון דיגיטלי מאפשרים ניתוח תא בודד ויוצרים microarray droplet המכיל תאים בודדים מעל microarray נוגדנים, אשר הוא אז הכתיר בשמן כדי למנוע אידוי. נפחי טיפות הם נפרדים כדי למנוע הפסד דגימה אחרת תושג ע י על שבב valving ב מיקרופלואידיקה זרימה רציפה. 30 כמות חלבון המטרה של תא בודד המוחלט הוא קטן מאוד; עם זאת, נפח מופחת טיפות מאפשר ריכוז מקומי גבוה יחסית כדי בכך שהם מזוהים באמצעות assay נוגדן של כריך – נוגדן הוא משותק באזור ברורים, או נקודה, על משטח אשר לוכדת חלבון אשר בתורו מאגד כדי fluorescently עם תוויות ברורות זיהוי נוגדנים נוכח האחסון droplet. כמו ללא תווית בגישה (כלומר חלבון מטרות לא צריך להיות מתויג ישירות), ארכיון דיגיטלי הם חלים באופן כללי על ניתוח תאים ממקורות ראשוניים, כגון דם מעובד, בסדר צריך aspirates הפומבית הגידול ביופסיות, כמו גם תאים מתרבות, lysates שלהם.
מדידת וריאציית בשפע חלבון לרוחב אוכלוסיה תא חשוב בקביעת את הטרוגניות בתגובה, לדוגמה, את הסם, יסייעו במתן תובנה תאיים מסלולים, הערכת subpopulations שלהם התנהגות כמו גם לזהות אירועים נדירים אחרת להיות רעולי פנים על ידי שיטות בצובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפיק ולהשתמש מיקרו-מערכים למיעון droplet כדי לקבוע באופן כמותי של השפע p53 פקטור שעתוק בתאים סרטניים אנושיים, עשוי לשמש כדי לחקור את התפקיד של p53 בתגובה תרופות כימותרפיות. חלבון המטרה נקבעת על-ידי הבחירה של נוגדנים לכידת וזיהוי, עשוי להיות שונה כדי לכלול יעדים שונים או יותר. ההוראות מסופקות כדי לבנות מנגנון פשוט שילוב זרבובית קונצנטריים מ ציוד מעבדה כללי כדי באופן ידני מערך 10 טיפות nL כתרים עם שמן. התהליך הניסויי מלא מתואר לפיה לכל droplet ואז נטען עם תא בודד, אשר לאחר מכן lysed, הביטוי של חלבונים נקבע עם רזולוציה מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרו-מערכים Droplet למיעון הם שיטה רגישה וניתן להרחבה לקביעת באופן כמותי את המספר המוחלט עותק של חלבונים בתוך תא בודד.
הגבלת הרמה של איגוד שאינם ספציפיים (נאצית) חיוני בתוך הפרוטוקול להשגת כמו נמוך מגבלה של זיהוי ככל האפשר. חלבונים ו מינים אחרים הביוכימי הלא ספציפית עלול להיקש…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR תוכנן ניסויים, פיתח פרוטוקולים, ניתחו נתונים. SC ו PS ביצע ניסויים גודל התא. ASR ו OC כתב היד. המחברים מאחלים לאשר בתודה את התמיכה של פרופסור דוד ר קלוג למתן גישה לציוד. המחברים רוצים להודות את אימפריאל קולג מתקדם Hackspace לגישה פבריקציה נוספת ומתקני טיפוס.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
Riferimenti
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. “One cell-one well”: A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip – Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
- Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA – Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
