पता करने वाली छोटी बूंद Microarrays के साथ एकल कोशिकाओं में प्रोटीन गिनती
Summary
यहाँ हम संबोधित करने योग्य छोटी बूंद microarrays (ADMs), एकल कोशिकाओं में पूर्ण प्रोटीन बहुतायत निर्धारित करने में सक्षम एक छोटी बूंद सरणी आधारित विधि मौजूद है । हम ADMs की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए एक मानव कैंसर कोशिका लाइन में ट्यूमर शमनकर्ता प्रोटीन p53 की अभिव्यक्ति में विविधता विशेषताएं ।
Abstract
अक्सर सेलुलर व्यवहार और सेलुलर प्रतिक्रियाओं जनसंख्या स्तर पर विश्लेषण कर रहे हैं, जहां कई कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं एक औसत एक जटिल आबादी के भीतर अमीर एकल कोशिका व्यवहार मास्किंग परिणाम के रूप में एक साथ परित हैं । एकल सेल प्रोटीन का पता लगाने और ठहराव प्रौद्योगिकियों हाल के वर्षों में एक उल्लेखनीय प्रभाव बना दिया है । यहाँ हम एक व्यावहारिक और लचीला एकल सेल विश्लेषण पता करने योग्य छोटी बूंद microarrays पर आधारित मंच का वर्णन. इस अध्ययन का वर्णन कैसे लक्ष्य प्रोटीन की निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या एकल सेल संकल्प के साथ मापा जा सकता है । ट्यूमर शमन करनेवाला p53 मानव कैंसर में सबसे अधिक रूपांतरित जीन है, कुल कैंसर एक गैर स्वस्थ p53 अभिव्यक्ति पैटर्न का प्रदर्शन के मामलों के ५०% से अधिक के साथ । प्रोटोकॉल जो एकल मानव कैंसर की कोशिकाओं को अलग कर रहे है और p53 प्रोटीन की प्रतिलिपि संख्या में एक अणु संकल्प के साथ ठीक अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता निर्धारित करने के लिए मापा जाता है 10 nL बूंदें बनाने के लिए कदम का वर्णन । विधि प्राथमिक सामग्री सहित किसी भी सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है ब्याज की किसी भी लक्ष्य प्रोटीन की निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या का निर्धारण ।
Introduction
इस विधि का लक्ष्य एक सेल संकल्प के साथ एक सेल जनसंख्या में एक लक्ष्य प्रोटीन की बहुतायत में भिंनता निर्धारित करने के लिए है । एकल सेल विश्लेषण पारंपरिक पहनावा जैव रासायनिक तरीकों के साथ उपलब्ध नहीं हैं कि लाभ के एक नंबर प्रदान करता है. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 सबसे पहले, एक सेल स्तर पर काम कर रहे है कि अंयथा औसत है कि पारंपरिक पहनावा जैव रासायनिक तकनीक के साथ होता है द्वारा खो जाएगा एक सेल की आबादी के अमीर विविधता पर कब्जा कर सकते हैं । काम के बहुमत-घोड़ा जैव रासायनिक तरीकों थोक के साथ काम करते हैं, की आवश्यकता होती है, के रूप में वे अक्सर करते हैं, कोशिकाओं के लाखों एक परिणाम का उत्पादन करने के लिए. बेशक, पूरे सेल की आबादी का आकलन करने के परिणाम कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति में विविधता जहां प्रोटीन बहुतायत के वितरण की कुछ महत्वपूर्ण सुविधाओं को याद किया जा सकता है । एक व्यावहारिक परिप्रेक्ष्य से, एक सेल तकनीक की आवश्यकता संवेदनशीलता उंहें जैविक सामग्री की मात्रा के साथ काम करने में सक्षम है कि और भी अधिक संवेदनशील थोक तकनीकों के लिए कार्य करने के लिए अपर्याप्त है । इस का एक महत्वपूर्ण उदाहरण इस तरह के ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी (CTCs) जहां भी एक गरीब शकुन outlook से कम 10 CTCs के साथ रोगियों के लिए एक एकल ७.५ मिलीलीटर रक्त ड्रा में मौजूद हो सकता है के रूप में दुर्लभ कोशिका प्रकार का अध्ययन है । 6 यहां हम एक कम मात्रा एंटीबॉडी आधारित तेल-छाया हुआ एक एंटीबॉडी microarray पर छपी बूंदों को रोजगार परख का उपयोग कर एकल कोशिका प्रोटीन माप प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं ।
Microfluidic छोटी बूंद प्लेटफार्मों उच्च प्रवाह कर रहे हैं, प्रति सेकंड बूंदों के हजारों उत्पंन करने में सक्षम है, और अलग करने में सक्षम है, और यहां तक कि संवर्धन, व्यक्तिगत बूंदों में एकल कोशिकाओं जैव रासायनिक परख की एक विस्तृत सरणी प्रदर्शन करने के लिए । छोटी बूंद-आधारित तकनीक अच्छी तरह से एकल सेल विश्लेषण,7,8,9 DropSeq10 और11ड्रॉप, जो बहुत की शक्ति से सहायता प्राप्त किया गया है सहित उल्लेखनीय हाल के उदाहरणों के साथ के लिए अनुकूल है प्रवर्धन तकनीक । सामग्री की सीमित मात्रा में और प्रोटीन के लिए प्रवर्धन का कोई तरीका नहीं एकल सेल प्रोटियोमिक् विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बना ।
बूंदों तरीकों की एक संख्या से विश्लेषण किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है । ऐसे कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के रूप में एकल अणु तकनीक फ्लोरोसेंट अणुओं अद्वितीय संकेत के साथ visualized करने के लिए शोर अनुपात की अनुमति देता है । 12 evanescent क्षेत्र की घातीय क्षय के कारण, सतह (100nm के आदेश) के लिए उच्च निकटता में केवल fluorophores एक जटिल मिश्रण में एक लक्ष्य अणु की छोटी मात्रा का पता लगाने में एक अच्छी रणनीति TIRF बनाने उत्साहित हैं । TIRF की अंतर्निहित ऑप्टिकल सेक्शनिंग ताकत भी धोने कदम और सीमा परख समय और जटिलता से बचने में मदद करता है । हालांकि, TIRF की आवश्यकता है planar सतहों और TIRF माइक्रोस्कोपी के उदाहरण प्रवाह में बूंदों के लिए लागू की एक planar सतह के गठन शामिल है जो छवि के लिए । 13 यह अंत करने के लिए, एकल सेल proteomic तकनीक अक्सर सतह के आसपास microfluidic चिप्स डिजाइन-मैटीरियल कैप्चर एजेंटों एक microarray प्रारूप में । 4 , 14
बूंदों, खुद, planar सतहों पर arrays में गठन किया जा सकता है, तथाकथित छोटी बूंद microarrays । 15 , 16 , 17 स्थानिक arrays में बूंदों का आयोजन उंहें आसानी से अनुक्रमित किया जा करने की अनुमति देता है, आसान समय पर नजर रखी, व्यक्तिगत रूप से संबोधित और, यदि आवश्यक हो, प्राप्त की । छोटी बूंद microarrays चिप जो या तो मुक्त खड़े या microwell संरचनाओं द्वारा समर्थित है प्रति तत्वों के हजारों के साथ सूक्ष्म रिएक्टरों के एक उच्च घनत्व को प्राप्त कर सकते हैं । 18 , 19 , 20 वे तरल हैंडलिंग रोबोट द्वारा अनुक्रमिक जमाव द्वारा गठित किया जा सकता है, inkjet निशानदेही, संपर्क microarrayers21,22,23,24,25, 26 या वे ऐसे superhydrophillic एक superhydrophobic सतह पर नमूनों धब्बे के रूप में सतहों पर आत्म इकट्ठा कर सकते हैं । 27 , 28 , 29
मन में इन विचारों के साथ, पता छोटी बूंद Microarrays (ADMs) बहुमुखी प्रतिभा, स्थानिक पता और छोटी बूंद के कम मात्रा में एक अणु TIRF माइक्रोस्कोप की संवेदनशीलता के साथ मात्रात्मक करने के लिए गठबंधन डिजाइन किए गए थे उपाय प्रोटीन बहुतायत । 5 ADMs सक्षम एकल सेल विश्लेषण एक छोटी बूंद microarray एक एंटीबॉडी microarray है, जो तो तेल के साथ छाया हुआ है वाष्पीकरण को रोकने पर युक्त एकल कोशिकाओं के गठन । बूंदों का आयतन नमूना हानि को रोकने के लिए असतत है, जो अन्यथा सतत प्रवाह microfluidics में ऑन-चिप valving द्वारा प्राप्त किया जाएगा । 30 एक ही कोशिका से लक्ष्य प्रोटीन की निरपेक्ष राशि बहुत छोटा है; हालांकि, बूंदों की कम मात्रा के क्रम में अपेक्षाकृत उच्च स्थानीय एकाग्रता के लिए अनुमति देता है कि वे एक सैंडविच एंटीबॉडी परख का उपयोग कर पता लगाया जाता है-एंटीबॉडी एक अलग क्षेत्र में मैटीरियल है, या स्पॉट, एक सतह है जो प्रोटीन जो बदले में बांधता है पर कब्जा छोटी बूंद मात्रा में मौजूद एक फ्लोरोसेंट लेबल का पता लगाने एंटीबॉडी करने के लिए । एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण के रूप में (यानी प्रोटीन लक्ष्य के लिए सीधे लेबल की जरूरत नहीं है), ADMs आम तौर पर प्राथमिक स्रोतों से कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं, जैसे संसाधित रक्त, ठीक की जरूरत है aspirates और असंबद्ध ट्यूमर बायोप्सी, साथ ही कोशिकाओं से संस्कृति और उनके lysates.
एक सेल जनसंख्या भर में प्रोटीन बहुतायत में भिंनता मापने के जवाब में विविधता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, एक दवा के लिए और सेलुलर कार्यों और रास्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद करेगा, उपजनसंख्या का आकलन और उनके व्यवहार के साथ ही दुर्लभ घटनाओं है कि अंयथा थोक तरीकों से नकाबपोश किया जाएगा की पहचान । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे उत्पादन और पता करने के लिए छोटी बूंदें microarrays का उपयोग मात्रात्मक मानव कैंसर की कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक p53 की बहुतायत निर्धारित करने के लिए और कीमोथेरेपी दवाओं के जवाब में p53 की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । लक्ष्य प्रोटीन कैप्चर और डिटेक्शन एंटीबॉडी के चयन के द्वारा निर्धारित किया जाता है और अधिक या विभिन्न लक्ष्यों को शामिल करने के लिए संशोधित हो सकता है । निर्देश के लिए एक सरल सामांय प्रयोगशाला उपभोग्य सामग्रियों से मैंयुअल रूप से 10 nL बूंदें तेल से ढकी एक गाढ़ा नोक शामिल तंत्र का निर्माण प्रदान की जाती हैं । पूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है जिससे प्रत्येक छोटी बूंद फिर लीजड ड और प्रोटीन की अभिव्यक्ति TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एकल अणु संकल्प के साथ निर्धारित है, जो एक एकल कोशिका के साथ भरी हुई है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पता करने योग्य छोटी बूंद Microarrays मात्रात्मक एक एकल कक्ष के भीतर प्रोटीन की निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या का निर्धारण करने के लिए एक संवेदनशील और एक्सटेंसिबल विधि हैं ।
गैर-विशिष्ट बाइंडिंग (NSB) के स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR डिज़ाइन किए गए प्रयोग, विकसित प्रोटोकॉल और विश्लेषण डेटा । एससी और पी एस सेल आकार प्रयोगों प्रदर्शन किया । ASR और OC पांडुलिपि लिखा था । लेखकों को आभारी करने के लिए उपकरणों का उपयोग प्रदान करने के लिए प्रो डेविड आर Klug के समर्थन को स्वीकार करना चाहता हूं । लेखकों को निर्माण और प्रोटोटाइप सुविधाओं के लिए उपयोग के लिए इंपीरियल कॉलेज उंनत Hackspace धंयवाद करना चाहता हूं ।
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
Riferimenti
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