Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio
Summary
Qui presentiamo indirizzabile gocciolina microarrays (ADMs), un metodo di matrice basata gocciolina in grado di determinare l’abbondanza assoluta della proteina in cellule singole. Dimostriamo la capacità di ADMs per caratterizzare l’eterogeneità nell’espressione della proteina oncosoppressore p53 in una linea cellulare di cancro umano.
Abstract
Comportamento spesso cellulare e risposte cellulari vengono analizzate a livello di popolazione, dove le risposte di molte cellule sono raggruppate insieme come un risultato medio il comportamento ricco singola cella all’interno di una popolazione complessa di mascheramento. Tecnologie di rilevazione e quantificazione della proteina singola cella hanno avuto un impatto notevole negli ultimi anni. Qui descriviamo una piattaforma di analisi unicellulare pratico e flessibile basata su microarrays gocciolina indirizzabile. Questo studio descrive come i numeri di copia assoluta di proteine bersaglio possono essere misurati con risoluzione di singola cellula. L’oncosoppressore p53 è il gene più comunemente mutato nel cancro umano, con oltre il 50% dei casi di cancro totale che esibiscono un modello di espressione di p53 non sani. Il protocollo descrive la procedura per creare 10 gocce nL entro il quale le cellule tumorali umane singolo sono isolate e il numero di copie della proteina p53 è misurato con risoluzione di singola molecola per determinare con precisione la variabilità nell’espressione. Il metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula compreso il materiale primario per determinare il numero di copia assoluta di qualsiasi proteine bersaglio di interesse.
Introduction
L’obiettivo di questo metodo è quello di determinare la variazione in abbondanza di una proteina dell’obiettivo in una popolazione di cellule con risoluzione di singola cellula. Analisi unicellulare fornisce una serie di vantaggi che non sono disponibili con metodi biochimici ensemble tradizionale. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in primo luogo, lavorare a livello di singola cellula può catturare l’eterogeneità ricca di una popolazione di cellule che altrimenti andrebbero persi il calcolando che si verifica con tecniche biochimiche ensemble tradizionale. La maggior parte dei metodi biochimici cavallo di lavoro funziona con la maggior parte, che richiedono, come spesso fanno, milioni di cellule per produrre un risultato. Naturalmente, le conseguenze della valutazione popolazioni a cellula intera dipende da una serie di fattori, ad esempio, l’eterogeneità nell’espressione della proteina dove possono essere perso alcune caratteristiche importanti della distribuzione dell’abbondanza di proteine. Dal punto di vista pratico, la sensibilità necessaria delle tecniche di singola cellula li rendono in grado di lavorare con quantità di materiale biologico che è insufficiente per anche più sensibili tecniche di bulk funzionare. Un esempio chiave è lo studio dei tipi cellulari rari come fare circolare le cellule del tumore (CTCs) dove anche per i pazienti con una prospettiva prognostico difficile meno di 10 CTCs potrebbero essere presenti in un singolo 7,5 mL di sangue disegnare. 6 qui presentiamo la metodologia necessaria per eseguire misurazioni di proteina singola cella usando un volume ridotto dosaggio anticorpo-basato che impiegano le goccioline di olio-capped stampato su un microarray dell’anticorpo.
Microfluidica gocciolina piattaforme sono a resa elevata, in grado di generare migliaia di goccioline al secondo e in grado di isolare e persino la coltura, singole cellule in singole gocce per eseguire una vasta gamma di analisi biochimiche. Tecniche basate su goccia sono adatti per analisi unicellulare,7,8,9 con notevoli esempi recenti tra cui DropSeq10 e inDrop11, che sono state notevolmente favorite dalla potenza di tecniche di amplificazione. La quantità limitata di materiale e senza metodi di amplificazione per proteine rendono unicellulare proteomica particolarmente impegnativi.
Le goccioline possono essere analizzate da un certo numero di metodi e microscopia di fluorescenza è stato ampiamente utilizzata. Tecniche di singola molecola come microscopia di fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale permette di molecole fluorescenti essere visualizzato con impareggiabile rapporto segnale-rumore. 12 a causa del decadimento esponenziale del campo evanescente, solo fluorofori in alta vicinanza alla superficie (ordine di 100nm) sono eccitati rendendo TIRF una buona strategia nella rilevazione di piccole quantità di una molecola di target in una miscela complessa. La forza intrinseca di sezionamento ottica di TIRF aiuta anche ad per evitare fasi di lavaggio e limiti di analisi tempi e la complessità. Tuttavia, TIRF richiede superfici planari ed esempi di microscopia TIRF applicato a goccioline nel flusso comportano la formazione di una superficie planare di cui all’immagine. 13 a tal fine, tecniche di proteomica di singola cellula spesso progettare chip microfluidici intorno agenti di superficie-immobilizzata cattura in un formato di microarray. 4 , 14
Le goccioline, essi stessi, possono essere formate in matrici su superfici planari, cosiddetto gocciolina microarrays. 15 , 16 , 17 organizzare spazialmente goccioline in matrici permette loro di essere convenientemente indicizzati, facilmente monitorati nel tempo, singolarmente indirizzati e, se necessario, Estratto. Gocciolina microarrays può raggiungere un’alta densità di micro-reattori con migliaia di elementi per ogni chip che sono supportati da strutture microtiter o autoportante. 18 , 19 , 20 può essere costituiti da deposizione sequenziale da robot di manipolazione dei liquidi, spotters a getto d’inchiostro, contattare microarrayers21,22,23,24,25, 26 , o essi possono assemblarsi su superfici come superhydrophillic macchie modellato su una superficie superidrofobiche. 27 , 28 , 29
Con queste considerazioni in mente, indirizzabile gocciolina Microarrays (ADMs) sono stati progettati per combinare la versatilità, spaziale indirizzabilità e volumi ridotti di microarrays di goccia con la sensibilità di microscopia TIRF di singola molecola per quantitativamente misurare l’abbondanza di proteine. 5 ADMs abilitare analisi unicellulare formando un gocciolina microarray contenente cellule singole sopra un microarray dell’anticorpo, che è stato limitato con olio per evitare l’evaporazione. I volumi delle goccioline sono discreti per prevenire la perdita di campione, che altrimenti si otterrebbe con il chip valvole a flusso continuo microfluidica. 30 la quantità assoluta di proteina bersaglio da una singola cellula è estremamente piccola; Tuttavia, il volume ridotto delle goccioline consente relativamente alta concentrazione locale in modo che essi vengono rilevati usando un’analisi di anticorpo panino – anticorpo è immobilizzato in una distinta regione, o spot, su una superficie che cattura la proteina che a sua volta lega per un anticorpo di rilevazione fluorescente etichettati presente nel volume delle gocce. Come un approccio privo di etichetta (cioè proteina gli obiettivi non devono essere etichettati direttamente), sono generalmente applicabili all’analisi di cellule da fonti primarie, come sangue trasformati ADMs, bene bisogno aspira e le biopsie del tumore dissociata, come pure le cellule dalla cultura e loro lisati.
Misura la variazione in abbondanza di proteine attraverso una popolazione delle cellule è importante nel determinare l’eterogeneità nella risposta, ad esempio, ad una droga e contribuirà a fornire approfondimenti funzioni cellulari e percorsi, valutazione sottopopolazioni e loro comportamento così come identificare eventi rari che altrimenti sarebbero mascherati da metodi di massa. Questo protocollo descrive come produrre e utilizzare indirizzabile gocciolina microarrays per determinare quantitativamente l’abbondanza del fattore trascrizione p53 in cellule tumorali umane e può essere usato per studiare il ruolo di p53 nella risposta ai farmaci chemioterapici. La proteina dell’obiettivo è determinata dalla scelta di acquisizione e rilevamento di anticorpi e può essere modificata per includere ulteriori o diverse destinazioni. Vengono fornite istruzioni per costruire un semplice apparato che incorporano un ugello concentrico da consumabili di laboratorio generali a 10 gocce di nL ricoperti con olio di matrice manualmente. Il processo completo sperimentale è descritto per cui ciascuna gocciolina viene quindi caricato con una singola cella, che è poi lisata e l’espressione della proteina determinata con risoluzione di singola molecola usando la microscopia TIRF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indirizzabile gocciolina Microarrays sono un metodo sensibile ed estensibile per determinare quantitativamente il numero assoluto di copia della proteina all’interno di una singola cella.
Limitare il livello di legame aspecifico (NSB) è critico all’interno del protocollo al raggiungimento di un limite di rilevazione possibile come basso. Proteine e altre specie biochimiche non specifico può associare a un numero di interfacce presenti all’interno le goccioline — la superficie del vetrino c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR progettato esperimenti, sviluppato protocolli e analizzato i dati. SC e PS eseguiti esperimenti di dimensione di cella. ASR e OC ha scritto il manoscritto. Gli autori desiderano riconosciamo con gratitudine il sostegno della Prof. ssa David R. Klug per l’accesso alle attrezzature. Gli autori desiderano ringraziare l’imperiale Hackspace di Advanced ha per l’accesso alle strutture di prototipazione e fabbricazione College.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
Riferimenti
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