Bruk av en rekombinant Mosquito Densovirus som et gen levering vektor for funksjonell analyse av gener i Larvene

Summary

Vi rapporterer bruker en kunstig intronic liten RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. En detaljert prosedyre for konstruksjon, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer så vel som for larver infeksjon er beskrevet.

Abstract

I vivo microinjection er mest brukte genet overføring teknikken for å analysere genet funksjonene i individuelle mygg. Men denne metoden krever en mer teknisk krevende operasjon og innebærer kompliserte prosedyrer, spesielt når de brukes i Larvene deres liten størrelse, relativt tynt og skjøre cuticle og høy dødelighet, som begrenser anvendelsen. Derimot er viral vektorer for gen levering utviklet for å overvinne ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy genet signaltransduksjon effektivitet, langsiktig vedlikehold av genuttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) er mygg-spesifikke, liten én-strandet DNA virus som kan effektivt levere utenlandsk nukleinsyrer til mygg celler. imidlertid fører erstatning eller innsetting av utenlandske gener å opprette rekombinant virus vanligvis til tap av emballasje og/eller replikering evner, som er et hinder for utviklingen av disse virusene som levering vektorer.

Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. Detaljerte fremgangsmåter, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer og larver infeksjon er beskrevet.

Denne studien viser, for første gang, muligheten for å utvikle en ikke-defekt rekombinant MDV micro RNA (miRNA) uttrykk system, og dermed gir et kraftig verktøy for funksjonell analyse av gener i mygg og etablere et grunnlag for den anvendelse av viral paratransgenesis for å kontrollere mygg-sykdommer. Vi viste at Aedes albopictus 1^st skikkelsen Larvene kan være enkelt og effektivt infisert av introdusere viruset i vannmassen næringsplante avl området og at den utviklet rAaeDVs kan brukes overexpress eller slå ned på uttrykk med et bestemt mål i larvene, gir et verktøy for funksjonsanalyse av mosquito gener.

Introduction

Mygg-sykdommer som malaria, denguefeber, zika feber og gul feber, er store internasjonale folkehelseproblemer som fortsatt står for en betydelig andel av de globale infeksjonssykdommer byrde^1,2. Konvensjonelle insektmidler, som har vært brukt i respons til vektorer, er en viktig komponent i bærekraftig integrert mygg strategi for forebygging av mygg-sykdommer. Men slike strategier har vist seg for å være relativt ineffektiv eller uønsket på grunn av tilknyttede negative miljøvirkninger samt utviklingen av motstand i mygg bestander^3,4. For disse grunner, det er et presserende behov for alternative metoder for mygg kontroll og bruk av transgene metoder for å produsere sterilt mannlige mygg og utgivelsen av patogen-resistente mygg har oppstått som lovende nye kontroll strategier. For å utvikle effektive nye kontroll metoder, som sikker og effektiv tilnærminger i vivo gen levering, av mygg gen funksjon er nødvendig.

Direkte microinjection av plasmider DNA, dobbel strandet RNA (dsRNA) eller lite forstyrrende RNA (siRNA) er mest brukte i vivo -genet leveringsmåte i mygg. Faktisk produksjon av transgene stammer av mygg fortsatt stole på en prosess av embryoet microinjection^5,6,7. Microinjection har imidlertid flere begrensninger. Først denne teknikken er teknisk krevende og innebærer kompliserte prosedyrer. Andre forårsaker injeksjon en fysisk fornærmelse til fosteret, larver, pupae og voksen, som direkte påvirker levedyktigheten til organismen mål. For det tredje er det vanskelig å nakkens Larvene for microinjection fordi de fleste bor i et akvatisk habitat og har en karakteristisk sprellende bevegelse. Fjerde, 1^st-2^nd skikkelsen Larvene er 10 – til 20 ganger mindre enn 4^th skikkelsen og eldre larver og neglebåndene av det tidligere er mer delikat. Disse funksjonene gjør det vanskelig å manipulere 1^st-2^nd skikkelsen Larvene sammenlignet med de i eldre stadier. Kombinert, bidra disse faktorene til en redusert etter injeksjon overlevelse for Larvene (ca 5%) sammenlignet med voksne⁸. Viral-baserte levering systemer er utviklet for å overvinne den tilknyttede ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy signaltransduksjon effektivitet, langsiktig og robust nivåer av uttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Derfor brukt genet leveringssystemer utnytte retroviruses, lentiviruses og adenoviruses har vært mye inmammalian linjer og modell arter. Sindbis viral uttrykk systemet hadde tidligere blitt brukt analysere funksjonen genet i voksen mosquito; Foruten de biosikkerhet bekymringene, men er injeksjon fortsatt nødvendig for virusinfeksjon⁹. Selv om muntlig levering av soaking larver i dsRNA løsningen er rapportert tidligere som en mulig leveringsmetode, er det uegnet for små RNA funksjonen analyse¹⁰. Så, effektiv viral leveringsmåter må fortsatt utvikles for myggen.

Mosquito densoviruses (MDVs) er en del av Densovirinae og Parvoviridae, og alle unntatt én ligger innenfor slekten Brevidensovirus¹¹. MDV virions er ikke innhyllet og består av en enkelt-strandet DNA (ssDNA) genom og en icosahedral kapsid (20 nm i diameter). Viral genomet er ca 4 kb inne størrelse og replikeres i kjerner i verten cellene. MDVs er relativt stabil i miljøet og viser mange smale vert med høy spesifisitet for myggen. Disse virusene har potensial til å spre og vedvarer naturlig mygg bestander og kan invadere nesten alle organer og vev av disse insekter, inkludert midttarmen, Malpighian tubuli, fett kroppen, muskulaturen, nerveceller og spyttkjertler¹².

Behold MDV genomer kan være subcloned i plasmider vektorer å produsere plasmider-baserte smittsomme kloner; Når disse Klonene leveres i mygg celler, er viral genomet er Hentet fra plasmider vektoren og smittsomme virus partikler produseres. Fordi MDV har en liten ssDNA genom, smittsomme kloner er enkelt konstruert og viral genomet kan være lett manipulert^11,13. Disse egenskapene gjør MDV en verdifull agent for å undersøke mygg biologi. Men fordi nesten alle viral genomet rekkefølgen er viktig for viral spredning, etableringen av rekombinant viruset gjennom erstatning eller innsetting av utenlandske gener forårsaker tap i viral emballasje og/eller replikering evner, som skaper en barriere for utviklingen av MDVs som Gen levering vektorer. Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rAaeDV i vivo RNA leveringssystem som har fordelene med enkel plasmider bygging og vedlikehold av en funksjonell virus som kan produsere stabil og langsiktig uttrykk i vertsceller uten behov for vill-type virus. I tillegg gir denne metoden enkel Albin på larvene.

Protokollene for fremgangsmåten er beskrevet i denne studien: 1) design av rAaeDVs koding en intronic liten-RNA uttrykk kassett, 2) produksjon av rekombinant viruspartikler med C6/36 emballasje cellen linje, 3) kvantitativ analyse for celle-fri rAaeDV genomet kopiere tall og 4) infeksjon i Ae. albopictus larver av direkte innføring av virus i selve vann larver habitat. Samlet vist denne arbeid at bestemte små RNAs eller mål gener kan overexpressed og slått ned i Larvene bruker utviklet MDV leveringssystem.

Protocol

alle protokoller ble godkjent av den etiske komiteen av Southern medisinsk University. 1. utforme en kunstig Intron Merk: den kunstige intron brukt i dette arbeidet er 65 bp i lengde, og rekkefølgen er 5 ' – GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG – 3 '. Sett Hpa jeg begrensning nettsted på begge ender av kunstige intron så at Hpa jeg fordøyelsen kan frigi intron fra plasmider (se …

Representative Results

Strategier for rAaeDV byggingEn defekt rAaeDV vektor ble generert for å uttrykke DsRed genet i larvene. Den resulterende plasmider inneholdt en NS1-DsRed fusion protein kassett med VP protein slettet (figur 1A). rAaeDV plasmider som inneholder uttrykket konstruksjoner for miRNA, ble miRNA svamp, shRNA og amiRNA utformet (vist i figur 1B). For eksempel ble en rAaeDV vektor ge…

Discussion

Det er viktig å overvinne to av de viktigste hindringene som begrenser rAaeDV konstruksjon. Først er produksjon av defekte rekombinant virus. Det har blitt rapportert at MDV kan brukes som en vektor uttrykke riktig størrelse utenlandske gener, som scorpion insekt-spesifikke neurotoxins20 og GFP protein; men uansett konstruksjon strategi form når ORFs MDV er satt inn eller erstattet med eksogene gener, virions ikke uavhengig med mindre en hjelper plasmider er cotransfected for å levere manglende uunnværlig virale pr…

Materials

Centrifuge machine	Thermo Scientific	75004260
Centrifuge System	Beckman Coulter	363118
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit	Omega Biotech	D6904
Purified Agar	OXOID	LP0028A
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL)	Thermo Scientific	EF0651
FastDigest HpaI	Thermo Scientific	FD1034
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	Thermo Scientific	EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell	Beijing Transgen Biotech	CD521-01
Ampicillin	Beijing Tiangen Biotech	RT501
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco， Life Technologies	21875109
Fetal Bovine Serum（ Australia Origin）	Gibco， Life Technologies	10099141
penicillin/streptomycin	Gibco， Life Technologies	15070063
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen，Life Technologies	11668019
Proteinase K	Promega	MC5008
DNase I (RNase-free)	Invitrogen，Life Technologies	AM2222
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205