मच्छर के लार्वा में जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक जीन वितरण वेक्टर के रूप में एक संयोजक मच्छर Densovirus का प्रयोग
Summary
हम vivo डिलिवरी सिस्टम में एक गैर दोषपूर्ण संयोजक एडीज aegypti densovirus (AaeDV) विकसित करने के लिए एक कृत्रिम intronic लघु आरएनए अभिव्यक्ति रणनीति का उपयोग कर रिपोर्ट । निर्माण, पैकेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया है, और rAaeDV वैक्टर के मात्रात्मक विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में लार्वा संक्रमण के लिए वर्णित है ।
Abstract
vivo में microinjection व्यक्तिगत मच्छरों में जीन कार्यों का विश्लेषण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जीन हस्तांतरण तकनीक है । हालांकि, इस विधि एक और अधिक तकनीकी रूप से मांग आपरेशन की आवश्यकता है और जटिल प्रक्रियाओं, खासकर जब उनके छोटे आकार, अपेक्षाकृत पतली और नाजुक छल्ली, और उच्च मृत्यु दर, जो अपने आवेदन की सीमा के कारण लार्वा में इस्तेमाल किया शामिल है । इसके विपरीत, जीन वितरण के लिए वायरल वैक्टर extracellular और intracellular बाधाओं को दुर्गम विकसित किया गया है । इन प्रणालियों आसान हेरफेर, उच्च जीन transduction दक्षता, जीन अभिव्यक्ति की दीर्घकालिक रखरखाव, और vivo मेंलगातार प्रभाव का उत्पादन करने की क्षमता के फायदे हैं । मच्छर densoviruses (MDVs) मच्छर-विशिष्ट, छोटे एकल असहाय डीएनए वायरस है कि प्रभावी रूप से मच्छर कोशिकाओं में विदेशी न्यूक्लिक एसिड उद्धार कर सकते हैं; हालांकि, प्रतिस्थापन या संयोजक वायरस बनाने के लिए विदेशी जीन की प्रविष्टि आम तौर पर पैकेजिंग और/या प्रतिकृति क्षमताओं, जो वितरण वैक्टर के रूप में इन वायरस के विकास के लिए एक बाधा है की एक हानि का कारण बनता है ।
साथ ही, हम vivo डिलिवरी सिस्टम में एक गैर-दोषपूर्ण संयोजक एडीज aegypti densovirus (AaeDV) विकसित करने के लिए एक कृत्रिम intronic लघु-आरएनए एक्सप्रेशन स्ट्रैटेजी का इस्तेमाल करते हुए रिपोर्ट करते हैं । rAaeDV वैक्टर के निर्माण, पैकेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं, और लार्वा संक्रमण के लिए वर्णित हैं ।
इस अध्ययन को दर्शाता है, पहली बार के लिए, एक गैर दोषपूर्ण संयोजक MDV माइक्रो आरएनए (miRNA) अभिव्यक्ति प्रणाली के विकास की व्यवहार्यता, और इस प्रकार मच्छर में जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने और के लिए एक आधार की स्थापना मच्छर जनित रोगों को नियंत्रित करने के लिए वायरल paratransgenesis के आवेदन । हमने दिखाया है कि एडीज albopictus 1सेंट instar लार्वा आसानी से और प्रभावी रूप से लार्वा प्रजनन स्थल के पानी के शरीर में वायरस शुरू करने से संक्रमित हो सकता है और विकसित rAaeDVs को व्यक्त करने या नीचे दस्तक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लार्वा में एक विशिष्ट लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति, मच्छर जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक उपकरण उपलब्ध कराने ।
Introduction
मलेरिया, डेंगू बुखार, zika बुखार, और पीले बुखार जैसे मच्छर जनित रोगों, प्रमुख अंतरराष्ट्रीय सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्याओं है कि वैश्विक संक्रामक रोग का बोझ1,2के एक महत्वपूर्ण अंश के लिए खाते में जारी कर रहे हैं । पारंपरिक कीटनाशकों, जो वैक्टर के जवाब में इस्तेमाल किया गया है, मच्छर जनित रोगों की रोकथाम के लिए स्थाई एकीकृत मच्छर नियंत्रण रणनीति का एक प्रमुख घटक हैं । हालांकि, इस तरह की रणनीतियों के लिए अपेक्षाकृत अप्रभावी या अवांछनीय कारण जुड़े नकारात्मक पर्यावरणीय प्रभावों के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मच्छर आबादी में प्रतिरोध के विकास में साबित हो3,4। इन कारणों के लिए, वहाँ मच्छर नियंत्रण के वैकल्पिक तरीकों के लिए एक तत्काल की जरूरत है, और बाँझ पुरुष मच्छरों की रिहाई और रोगजनक प्रतिरोधी मच्छरों का उत्पादन करने के लिए ट्रांसजेनिक तरीकों का उपयोग नई नियंत्रण रणनीतियों के रूप में आशाजनक पैदा हुई है । के लिए प्रभावी नए नियंत्रण विधियों, जैसे सुरक्षित और प्रभावी दृष्टिकोण विकसित करने के लिए vivo में जीन डिलिवरी, मच्छर जीन समारोह के व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता है ।
प्लाज्मिड डीएनए, डबल कतरा आरएनए (dsRNA) या छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) के प्रत्यक्ष microinjection मच्छरों में vivo जीन वितरण विधि में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है । वास्तव में, मच्छरों के ट्रांसजेनिक उपभेदों के उत्पादन में अभी भी भ्रूण microinjection की एक प्रक्रिया5,6,7पर भरोसा करते हैं । हालांकि, microinjection कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, इस तकनीक तकनीकी तौर पर मांग है और जटिल प्रक्रियाओं शामिल है । दूसरा, इंजेक्शन भ्रूण, लार्वा, कोषस्थों, और वयस्क, जो सीधे लक्ष्य जीव की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है के लिए एक शारीरिक अपमान का कारण बनता है । तीसरा, यह microinjection के लिए मच्छर के लार्वा को स्थिर करना मुश्किल है क्योंकि ज्यादातर एक जलीय निवास स्थान में रहते है और एक विशेषता wriggling आंदोलन के अधिकारी हैं । चौथा, 1st-2एन डी instar लार्वा के आकार में 4th instar और पुराने लार्वा की तुलना में 10-से 20 गुना छोटे होते हैं, और पूर्व के cuticles अधिक नाजुक होते हैं । इन सुविधाओं के पुराने चरणों में उन लोगों की तुलना में 1st-2एनडी instar लार्वा में हेरफेर करने के लिए मुश्किल बना । संयुक्त, इन कारकों लार्वा के लिए एक कम पोस्ट इंजेक्शन जीवित रहने की दर में योगदान (लगभग 5%)8वयस्कों की तुलना में । एसोसिएटेड extracellular और intracellular बाधाओं को दूर करने के लिए वायरल आधारित डिलिवरी सिस्टम विकसित किया गया है । इन प्रणालियों आसान हेरफेर, उच्च transduction दक्षता, दीर्घकालिक और अभिव्यक्ति की मजबूत स्तर, और vivo मेंलगातार प्रभाव का उत्पादन करने की क्षमता के फायदे हैं । इसलिए, जीन वितरण प्रणाली का उपयोग retroviruses, lentiviruses, और एडिनोवायरस व्यापक रूप से सेल लाइनों और मॉडल प्रजातियों inmammalian इस्तेमाल किया गया है । Sindbis वायरल अभिव्यक्ति प्रणाली पहले वयस्क मच्छर में जीन समारोह का विश्लेषण किया गया था; इसके अलावा, सुरक्षा चिंताओं, हालांकि, इंजेक्शन अभी भी वायरल संक्रमण के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है9। हालांकि, dsRNA समाधान में लार्वा सोख द्वारा मौखिक प्रसव पहले एक व्यवहार्य वितरण पद्धति के रूप में बताया गया है, यह छोटी आरएनए समारोह विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है10। तो, प्रभावी वायरल प्रसव के तरीकों अभी भी मच्छरों के लिए विकसित किया जाना चाहिए ।
मच्छर densoviruses (MDVs) Parvoviridaeके Densovirinae उपपरिवार का हिस्सा हैं, और जीनस Brevidensovirus11के भीतर सभी लेकिन एक गिर जाते हैं । MDV virions गैर-ढंक रहे है और एक एकल फंसे डीएनए (ssDNA) जीनोम और एक icosahedral कैप्सिड (व्यास में 20 एनएम) से मिलकर बनता है । वायरल जीनोम आकार में लगभग 4 केबी है और मेजबान कोशिकाओं के नाभिक के भीतर की प्रतिकृति है । MDVs पर्यावरण में अपेक्षाकृत स्थिर है और मच्छरों के लिए उच्च विशिष्टता के साथ एक संकीर्ण मेजबान रेंज दिखा । इन वायरस के प्रसार और मच्छर आबादी में स्वाभाविक रूप से जारी रखने की क्षमता है और लगभग सभी अंगों और इन कीड़ों के ऊतकों midgut, Malpighian नलिकाओं, वसा शरीर, पेशियां, न्यूरॉन्स, और लार ग्रंथियों सहित, आक्रमण कर सकते हैं12.
बरकरार MDV जीनोम प्लाज्मिड वैक्टर में उपक्लोन किया जा सकता है प्लाज्मिड-आधारित संक्रामक क्लोन का उत्पादन; जब इन क्लोनों मच्छर कोशिकाओं में वितरित कर रहे हैं, वायरल जीनोम प्लाज्मिड वेक्टर से निकाला जाता है, और संक्रामक वायरल कणों का उत्पादन कर रहे हैं । क्योंकि MDV एक छोटे ssDNA जीनोम है, संक्रामक क्लोन आसानी से निर्माण कर रहे है और वायरल जीनोम आसानी से हेरफेर किया जा सकता है11,13। इन विशेषताओं MDV मच्छर जीवविज्ञान की जांच के लिए एक मूल्यवान एजेंट बनाते हैं । हालांकि, क्योंकि लगभग वायरल जीनोम अनुक्रम के सभी वायरल प्रसार के लिए आवश्यक है, प्रतिस्थापन या विदेशी जीन की प्रविष्टि के माध्यम से संयोजक वायरस के निर्माण वायरल पैकेजिंग में एक नुकसान का कारण बनता है और/या प्रतिकृति क्षमता है, जो बनाता है एक जीन वितरण वैक्टर के रूप में MDVs के विकास के लिए बाधा । इस के साथ साथ, हम एक कृत्रिम intronic लघु-आरएनए अभिव्यक्ति रणनीति का उपयोग कर vivo आरएनए वितरण प्रणाली है कि आसान प्लाज्मिड निर्माण के फायदे है और एक कार्यात्मक वायरस है कि उत्पादन कर सकते है के रखरखाव में एक गैर दोषपूर्ण rAaeDV विकसित करने के लिए रिपोर्ट जंगली प्रकार के वायरस की आवश्यकता के बिना मेजबान कोशिकाओं में स्थिर और दीर्घकालिक अभिव्यक्ति । इसके अतिरिक्त, इस विधि के लिए लार्वा की आसान transduction के लिए अनुमति देता है ।
निंनलिखित चरणों के लिए प्रोटोकॉल इस अध्ययन में वर्णित हैं: 1) एक intronic छोटी-आरएनए अभिव्यक्ति कैसेट, 2) संयोजक वायरस के उत्पादन की rAaeDVs एंकोडिंग के डिजाइन-सी 6/36 पैकेजिंग सेल लाइन, 3) सेल के मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग कर मुक्त rAaeDV जीनोम कॉपी नंबर, और 4) लार्वा वास के जल शरीर में वायरस का सीधा परिचय द्वारा एई. albopictus लार्वा के संक्रमण । कुल मिलाकर, इस काम का प्रदर्शन किया है कि विशिष्ट छोटे RNAs या लक्ष्य जीन को व्यक्त या मच्छर के लार्वा में नीचे खटखटाया विकसित MDV वितरण प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं ।
Protocol
सभी प्रोटोकॉल को दक्षिणी आयुर्विज्ञान विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. डिजाइनिंग एक आर्टिफिशियल Intron
नोट: इस काम में इस्तेमाल होने वाले आर्टिफिशियल In…
Representative Results
Discussion
यह महत्वपूर्ण है कि rAaeDV निर्माण की सीमा के दो महत्वपूर्ण बाधाओं को दूर करने के लिए । पहले दोषपूर्ण संयोजक वायरस का उत्पादन होता है । यह बताया गया है कि MDV एक वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है उचित ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFC1200500 जिओ-Guang चेन), चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६७२०५४ और ८१३७१८४६), प्राकृतिक के अनुसंधान दल के कार्यक्रम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । गुआंग्डोंग के विज्ञान फाउंडेशन (2014A030312016), और गुआंगज़ौ के वैज्ञानिक और तकनीकी कार्यक्रम (२०१५०८०२०२६३) । हम कृतज्ञता के लिए प्रोफेसर जोनाथन कार्लसन (कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय स्वीकार करते हैं) कृपया pUCA और p7NS1-GFP plasmids प्रदान करने के लिए और गंभीर रूप से इस पांडुलिपि पढ़ने के लिए ।
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Riferimenti
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
