In Situ MHC-tetramer farvning og kvantitativ analyse til at bestemme placering, overflod og fænotype af Antigen-specifikke CD8 T celler i væv
Summary
Her, beskriver vi en metode, der kombinerer i situ MHC-tetramer farvning med Immunhistokemi at bestemme lokalisering, fænotype og mængden af antigen-specifikke T-celler i væv. Denne protokol bruges til at bestemme de rumlige og fænotypiske egenskaber af antigen-specifikke CD8 T celler i forhold til andre celletype og strukturer i væv.
Abstract
T celler er vigtige for mange immunologiske processer, herunder opdage og fjerne virus-inficerede celler, forhindrer autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produktion af antistoffer, og opdage og fjerne kræftceller. Udviklingen af MHC-tetramer farvning af antigen-specifikke T-celler analyseret ved flowcytometri har revolutioneret vores evne til at studere og forstå immunobiology af T-celler. Yderst nyttige til at bestemme mængden og fænotype af antigen-specifikke T-celler, kan ikke flowcytometri bestemme den geografiske lokalisering af antigen-specifikke T-celler til andre celler og strukturer i væv og nuværende opdeling teknikker for at udtrække T behov celler for flowcytometri har begrænset effektiviteten i ikke-lymfoide væv. In situ MHC-tetramer farvning (IST) er en teknik til at visualisere T-celler, der er specifikke for antigener af interesse i væv. I kombination med Immunhistokemi (IHC), kan IST bestemme overflod, placering og fænotype af antigen-specifikke CD8 og CD4 T celler i væv. Her, beskriver vi en protokol for at pletten og optælle antigen-specifikke CD8 T-celler med specifikke fænotyper ligger inden for specifikke væv rum. Disse procedurer er de samme som vi brugte i vores seneste publikation af Li et al., med titlen “Simian immundefektvirus-producerende celler i follikler er delvist undertrykt af CD8 celler,+ In Vivo.” De beskrevne metoder er stort set gældende, fordi de kan bruges til at lokalisere, fænotype, og kvantificere det væsentlige alle antigen-specifikke CD8 T celler som MHC tetramers der findes i alle væv.
Introduction
T celler er vigtige for mange immunologiske processer, herunder opdage og fjerne virus-inficerede celler, forhindrer autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produktion af antistoffer, og opdage og fjerne kræftceller. Udviklingen af peptid/MHC klasse I tetramer farvning af antigen-specifikke CD8 T celler1 og den nyere udvikling af MHC klasse II tetramer farvning af CD4 T celler2 ved flowcytometri revolutioneret vores evne til at studere og forstå de Immunobiology af T-celler. Yderst nyttige til at bestemme mængden og fænotype af antigen-specifikke T-celler, tillader flowcytometri ikke til påvisning af den geografiske lokalisering af antigen-specifikke T-celler til andre celler og strukturer i væv, og nuværende opdeling teknikker til at udvinde T celler behov for flowcytometri har begrænset effektiviteten i ikke-lymfoide væv3.
Vi og andre har udviklet metoder bruger peptid-læsset MHC klasse I og klasse II tetramer eller multimer reagenser til pletten antigen-specifikke CD8 og CD4 T celler i væv4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse IST metoder give til bestemmelse af placering, overflod og fænotype af antigen-specifikke CD8 og CD4 T celler i væv og give et middel til at opdage disse celler i forhold til andre celler og strukturer i væv. Vores gruppe har flittigt brugt MHC-jeg tetramer farvning for at studere human immundefekt virus (HIV)- og simian immundefektvirus (SIV) – specifikke CD8 T celler i lymfoide, kønsorganer og rektal væv til at opnå en forståelse af HIV og SIV immunpatogenese og at identificere korrelerer vellykkede vaccination strategier14,15,16,17. Derudover udviklet vi også en teknik, der kombinerer IST med i situ hybridisering (ISH) at lokalisere og kvantificere virus-specifikke CD8 T celler og virus-inficerede celler i væv og til at bestemme in vivo effektor-til-målet-niveauer 18 , 19.
Her, vi beskriver en protokol bruger peptid-læsset MHC-jeg tetramers til at plette antigen-specifikke CD8 T celler i frisk væv sektioner, til kontrastfarve væv ved hjælp af IHC og kvantificere celler med specifikke fænotyper i bestemte væv rum. Disse procedurer er de samme som blev brugt i vores seneste publikation af Li et al., hvor vi bestemt placering, overflod og fænotype af SIV-specifikke T-celler i lymfoide væv under kronisk SIV infektion i makakaber20.
For denne procedure, frisk væv i snit og inkuberes natten over med peptid-læsset MHC-jeg tetramers konjugeret til fluorescein kaliumthiocyanat molekyler (FITC). De er så fast i PARAFORMALDEHYD. Efter fastsættelsen af væv, forstærkes signalet fra MHC-tetramers ved hjælp af kanin anti-FITC antistoffer og inkuberes med fluorescently mærket anti-kanin IgG antistoffer, som yderligere forstærker signalet fra de bundne tetramers. IHC bruges i forbindelse med IST til at karakterisere antigen-specifikke T-celler og omkringliggende celler. Antistoffer, der genkender epitoper på overfladen af celler eller i det ekstracellulære rum er inkluderet i den primære inkubering med en tetramers. Antistoffer, der genkender intracellulære epitoper kræver gennemtrængning af cellevæggen før farvning. Afsnittene farves væv er afbildet ved hjælp af en Konfokal mikroskop og analyseret ved hjælp af Konfokal software. Mærket celler er kvantificeret konfokalmikroskopi software eller ImageJ. Den beskrevne protokol kan bruges til at plette hovedsagelig alle antigen-specifikke CD8 T celler i alle væv for hvilke MHC-jeg tetramers er tilgængelige.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST kombineret med IHC giver et vigtigt redskab for påvisning, kendetegner og kvantificere antigen-specifikke CD8 T celler i native miljøer med konteksten af andre celler og væv strukturer. Her, beskrevet vi nærmere procedurer for IST kombineret med IHC, efterfulgt af kvantitative billedanalyse, til at bestemme placering, overflod og fænotype af antigen-specifikke CD8 T-celler i lymfeknuder fra rhesus makakaber. Lignende farvning kan blive anvendt til menneskelige, mus, eller andre arter væv for hvilke MHC-jeg tetr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud fra National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Riferimenti
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
