In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels
Summary
Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.
Abstract
T-cellen zijn cruciaal voor veel immunologische processen, waaronder opsporen en elimineren van virus-geïnfecteerde cellen voorkomen autoimmuniteit, assisteren bij B-cel en plasma-cel productie van antilichamen, opsporen en elimineren van kankercellen. De ontwikkeling van MHC-tetrameer kleuring van antigeen-specifieke T-cellen geanalyseerd door stroom cytometry heeft een revolutie teweeggebracht in ons vermogen te bestuderen en begrijpen van de Immunobiologie van T-cellen. Terwijl uiterst nuttig voor het bepalen van de hoeveelheid en het fenotype van antigeen-specifieke T-cellen, kan niet stroom cytometry bepalen wat de ruimtelijke lokalisatie van antigeen-specifieke T-cellen naar andere cellen en structuren in de weefsels, en huidige aggregatieniveau technieken om uit te pakken van de T die nodig zijn cellen voor stroom cytometry hebben beperkte doeltreffendheid in niet-lymfoïde weefsels. In situ MHC-tetrameer kleuring (IST) is een techniek om te visualiseren van T-cellen die specifiek voor antigeen van belang in de weefsels zijn. In combinatie met immunohistochemistry (IHC), kunt IST bepalen de overvloed, locatie en fenotype van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels. Hier beschrijven we een protocol om de vlek en inventariseren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, met specifieke fenotypen gelegen binnen specifieke weefsel compartimenten. Deze procedures zijn dezelfde die we in onze recente publicatie door Li et al. gebruikt, getiteld “Simian Immunodeficiëntie Virus-producerende cellen in de follikels gedeeltelijk onderdrukt door CD8+ cellen In Vivo.” De beschreven methoden zijn breed toepasbare omdat ze kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren, fenotype, en in wezen een antigeen-specifieke CD8 T-cel waarvoor MHC tetramers beschikbaar zijn, in elk weefsel te kwantificeren.
Introduction
T-cellen zijn cruciaal voor veel immunologische processen, waaronder opsporen en elimineren van virus-geïnfecteerde cellen voorkomen autoimmuniteit, assisteren bij B-cel en plasma-cel productie van antilichamen, opsporen en elimineren van kankercellen. De ontwikkeling van peptide/MHC klasse I tetrameer kleuring van antigeen-specifieke CD8 T cellen1 en de meer recente ontwikkeling van de MHC klasse II tetrameer kleuring van CD4 T cellen2 door stroom cytometry een revolutie teweeggebracht in ons vermogen te bestuderen en begrijpen de Immunobiologie van T-cellen. Terwijl uiterst nuttig voor het bepalen van de hoeveelheid en het fenotype van antigeen-specifieke T-cellen, stroom cytometry niet mogelijk voor de detectie van de ruimtelijke lokalisatie van antigeen-specifieke T-cellen naar andere cellen en structuren in de weefsels, en de huidige aggregatieniveau technieken om uit te pakken van de T-cellen die nodig zijn voor stroom cytometry hebben beperkte doeltreffendheid in niet-lymfoïde weefsels3.
Wij en anderen hebben ontwikkeld methoden met peptide-geladen MHC klasse I en klasse II tetrameer of multimer reagentia vlek van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. deze IST methoden voor de bepaling van de locatie, overvloed en fenotype van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels verlenen en een middel om het detecteren van deze cellen ten opzichte van andere cellen en structuren in de weefsels. Onze fractie heeft uitgebreid gebruikt voor MHC-ik tetrameer vlekken om te bestuderen van humaan immunodeficiëntie virus (HIV)- en simian immunodeficiëntie virus (SIV) – specifieke CD8 T-cellen in de lymfoïde, genitale en rectale weefsels een inzicht van HIV en SIV immunopathogenese en te identificeren correlaten van succesvolle vaccinatie strategieën14,15,16,17. Daarnaast ontwikkeld we ook een techniek die IST met in situ hybridisatie (ISH combineert) te lokaliseren en te kwantificeren van virus-specifieke CD8 T cellen en virus-geïnfecteerde cellen in weefsels en om te bepalen van de in vivo effector-tot-streefpad niveaus 18 , 19.
Hier beschrijven we een protocol met behulp van peptide-geladen MHC-ik tetramers om vlek van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in de weefselsecties van vers, tot counterstain weefsels met behulp van IHC en te kwantificeren van cellen met specifieke fenotypen in specifieke weefsel compartimenten. Deze procedures zijn dezelfde als in onze recente publicatie werden gebruikt door Li et al., waarin wij de locatie, overvloed en fenotype van SIV-specifieke T-cellen in de lymfoïde weefsel tijdens chronische SIV infectie in Makaken20 vastbesloten.
Voor deze procedure, verse weefsels zijn gesegmenteerd en ‘s nachts geïncubeerd met peptide-geladen MHC-ik tetramers geconjugeerd met fluoresceïne kaliumthiocyanaat moleculen (FITC). Ze worden dan opgelost met paraformaldehyde. Na de vaststelling van het weefsel, wordt het signaal van de MHC tetramers versterkt met behulp van konijn anti-FITC antilichamen en geïncubeerd met fluorescently tagged anti-konijn IgG antilichamen, die het signaal van de afhankelijke tetramers verder te versterken. IHC wordt gebruikt in combinatie met IST te karakteriseren van antigeen-specifieke T-cellen en de omringende cellen. Antilichamen die herkennen epitopes op het oppervlak van cellen of in de extracellulaire ruimte zijn opgenomen in de primaire incubatie met de tetramers. Antilichamen die intracellulaire epitopes herkent vereisen permeatie van de celwand voorafgaand aan kleuring. De gekleurde weefselsecties zijn beeld met behulp van een confocal microscoop en geanalyseerd met behulp van de confocal software. Gelabelde cellen worden gekwantificeerd aan de hand van de confocal microscopie software of ImageJ. De beschreven protocol kan worden gebruikt om vlek in wezen een antigeen-specifieke CD8 T cel in elk weefsel voor welke MHC-ik tetramers zijn beschikbaar.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST gecombineerd met IHC biedt een essentieel instrument voor het opsporen, karakteriseren, en kwantificeren van antigeen-specifieke CD8 T cellen in native omgevingen met de context van andere cellen en weefsel structuren. Hier, beschreven we gedetailleerde procedures voor het IST gecombineerd met IHC, gevolgd door kwantitatieve beeldanalyse, om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in de lymfeklieren van rhesus makaken. Soortgelijke kleuring kan worden toegepast op de mens…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Public Health Service verleent van de National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Riferimenti
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
