In Situ MHC-tétramère de coloration et d’analyse Quantitative pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les tissus
Summary
Nous décrivons ici une méthode qui combine in situ MHC-tétramère de coloration avec l’immunohistochimie pour déterminer la localisation, phénotype et la quantité de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les tissus. Ce protocole est utilisé pour déterminer les caractéristiques spatiales et phénotypiques des cellules CD8 T antigène-spécifiques par rapport à d’autre type de cellule et de structures dans les tissus.
Abstract
Les lymphocytes T sont essentiels pour beaucoup de processus immunologiques, y compris la détection et élimination des cellules infectées par le virus, empêchant l’auto-immunité, aidant à la production de B-cellule et cellule-plasma des anticorps et détecter et éliminer les cellules cancéreuses. Le développement de MHC-tétramère de coloration des cellules de T antigène-spécifiques analysés par cytométrie en flux a révolutionné notre capacité à étudier et comprendre l’immunobiologie des cellules T. Bien qu’extrêmement utiles pour déterminer la quantité et le phénotype des cellules T spécifiques de l’antigène, cytométrie de flux ne peut pas déterminer la localisation spatiale des lymphocytes T spécifiques de l’antigène à d’autres cellules et structures dans les tissus et les techniques actuelles de désagrégation pour extraire le T cellules nécessaires à la cytométrie ont une efficacité limitée dans les tissus non lymphoïdes. In situ MHC-tétramère coloration (IST) est une technique permettant de visualiser les cellules T spécifiques d’antigènes d’intérêt dans les tissus. En combinaison avec l’immunohistochimie (IHC), IST peut déterminer l’abondance, localisation et phénotype des cellules CD8 et CD4 T antigène-spécifiques des tissus. Nous décrivons ici un protocole pour la tache et énumérer les cellules CD8 T antigène-spécifiques, avec des phénotypes spécifiques situés à l’intérieur des compartiments de tissus spécifiques. Ces procédures sont les mêmes que nous avons utilisé dans notre publication récente par Li et al., intitulé « cellules productrices des Virus de l’immunodéficience simienne de follicules sont partiellement supprimée par CD8 cellules+ In Vivo.” Les méthodes décrites sont largement applicables parce qu’ils peuvent servir à localiser, phénotype et quantifier essentiellement n’importe quelle cellule CD8 T antigène-spécifiques pour lesquels les tétramères MHC sont disponibles, dans n’importe quel tissu.
Introduction
Les lymphocytes T sont essentiels pour beaucoup de processus immunologiques, y compris la détection et élimination des cellules infectées par le virus, empêchant l’auto-immunité, aidant à la production de B-cellule et cellule-plasma des anticorps et détecter et éliminer les cellules cancéreuses. Le développement de peptide/MHC classe I tétramère coloration spécifique de l’antigène des cellules T CD81 et le récent développement de MHC classe II tétramère dégorgement des lymphocytes T CD4 des cellules2 par cytométrie en flux a révolutionné notre capacité à étudier et comprendre le immunobiologie des cellules T. Bien qu’extrêmement utiles pour déterminer la quantité et le phénotype des cellules T spécifiques de l’antigène, cytométrie de flux ne permet pas la détection de la localisation spatiale des lymphocytes T spécifiques de l’antigène à d’autres cellules et structures dans les tissus et actuel techniques de ventilation pour extraire les cellules T nécessaires pour la cytométrie en flux ont une efficacité limitée dans les tissus non lymphoïdes3.
Nous et autres avons mis au point des méthodes à l’aide de chargement peptide MHC classe I et classe tétramère II ou multimères réactifs pour colorer les cellules CD8 et CD4 T antigène-spécifiques en tissus4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST ces méthodes permettent la détermination de l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules CD8 et CD4 T antigène-spécifiques des tissus et fournir un moyen de détecter ces cellules par rapport à d’autres structures dans les tissus et cellules. Notre groupe a largement utilisé MHC-j’ai tétramère coloration afin d’étudier le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) – et le virus de l’immunodéficience simienne (vis) – des cellules T CD8 spécifiques dans les tissus lymphoïdes, génitales et rectales à acquérir une compréhension de l’immunopathogenèse du VIH et SIV et de définir les corrélats des stratégies de vaccination réussie14,15,16,17. En outre, nous avons également développé une technique qui combine IST avec hybridation in situ (ISH) pour localiser et quantifier les cellules T CD8 spécifiques du virus et les cellules infectées par le virus dans les tissus et pour déterminer les niveaux d’effecteur-cible en vivo 18 , 19.
Nous décrivons ici un protocole utilisant chargés en peptide MHC-j’ai tétramères pour colorer les cellules CD8 T antigène-spécifiques dans les sections de tissu frais, de contre-colorant tissus par IHC et de quantifier les cellules avec des phénotypes spécifiques dans des compartiments de tissus spécifiques. Ces procédures sont les mêmes comme étaient utilisés dans notre publication récente par Li et al., dans lequel nous avons déterminé l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T spécifiques SIV dans les tissus lymphoïdes au cours de l’infection chronique par le SIV dans macaques20.
Pour cette procédure, tissus frais sont sectionnés et incubés durant une nuit avec chargement peptide MHC-j’ai tétramères conjugués à des molécules de thiocyanate de fluorescéine (FITC). Elles sont ensuite fixées à la paraformaldéhyde. Après avoir résolu le tissu, le signal provenant des tétramères de MHC est amplifié à l’aide d’anticorps de lapin anti-FITC et incubées avec les anticorps d’IgG anti-lapin fluorescent étiquetés, qui encore amplifient le signal des tétramères liés. IHC est utilisé en conjonction avec IST pour caractériser les cellules T spécifiques de l’antigène et les cellules environnantes. Anticorps qui reconnaissent des épitopes sur la surface des cellules ou dans l’espace extracellulaire sont inclus lors de l’incubation primaire avec les tétramères. Anticorps qui reconnaissent des épitopes intracellulaires exigent la perméabilité de la paroi cellulaire avant la coloration. Les coupes de tissus colorés sont imagés à l’aide d’un microscope confocal et analysées à l’aide de logiciels confocale. Cellules marquées sont quantifiés à l’aide de logiciels de microscopie confocale ou ImageJ. Le protocole décrit peut être utilisé pour colorer essentiellement n’importe quelle cellule CD8 T antigène-spécifiques dans n’importe quel tissu pour laquelle MHC-j’ai tétramères sont disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST combiné avec IHC fournit un outil essentiel pour détecter, caractériser et quantifier les cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les environnements natifs avec le contexte d’autres cellules et les structures tissulaires. Ici, nous avons décrit des procédures détaillées pour IST combiné avec l’IHC, suivie de l’analyse quantitative d’image, afin de déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les ganglions lymphatiques des m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Service de santé publique accorde de la National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Riferimenti
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