In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode, die kombiniert in Situ MHC-Tetramer Färbung mit Immunohistochemistry, Lokalisierung, Phänotyp und Menge an Antigen-spezifische T-Zellen im Gewebe zu bestimmen. Dieses Protokoll wird verwendet, um die räumliche und phänotypischen Merkmale der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen im Vergleich zu anderen Zelltyp und Strukturen im Gewebe zu bestimmen.
Abstract
T-Zellen sind entscheidend für viele immunologische Prozesse, einschließlich der Erkennung und Beseitigung von Virus-infizierten Zellen, verhindert Autoimmunität, Unterstützung bei der B-Zellen und Plasma-Zelle Produktion von Antikörpern und Aufspüren und eliminieren von Krebszellen. Die Entwicklung der MHC-Tetramer Färbung von antigenspezifischen T-Zellen durch Durchflusszytometrie analysiert revolutioniert unsere Fähigkeit zu untersuchen und verstehen die Immunbiologie der T-Zellen. Während äußerst nützlich für die Bestimmung der Menge und der Phänotyp der antigenspezifischen T-Zellen, bestimmen nicht Durchflusszytometrie die räumliche Lokalisation der antigenspezifischen T-Zellen auf andere Zellen und Strukturen im Gewebe und aktuellen Disaggregation Techniken. zum Extrahieren der T benötigt Zellen für Durchflusszytometrie Wirksamkeit in nicht-lymphatischen Geweben eingeschränkt haben. In situ MHC-Tetramer Färbung (IST) ist eine Technik, T-Zellen zu visualisieren, die spezifisch für Antigene von Interesse im Gewebe sind. In Kombination mit Immunhistochemie (IHC) bestimmen IST die Fülle, Standort und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen in den Geweben. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Flecken und Antigen-spezifischen CD8 T-Zellen, mit bestimmten Phänotypen befindet sich in bestimmte Gewebe Fächer aufzählen. Diese Verfahren sind die gleichen, die wir in unserem kürzlich erschienenen Publikation von Li Et Al., unter dem Titel verwendet “Simian Immunodeficiency Virus-produzierenden Zellen im Follikel werden teilweise unterdrückt durch CD8 Zellen+ In Vivo.” Die beschriebenen Methoden sind breit anwendbar, weil sie verwendet werden, können um zu lokalisieren, Phänotyp, und im wesentlichen Antigen-spezifischen CD8 T Zelle für die MHC-Tetramers in jedem Gewebe vorliegen, zu quantifizieren.
Introduction
T-Zellen sind entscheidend für viele immunologische Prozesse, einschließlich der Erkennung und Beseitigung von Virus-infizierten Zellen, verhindert Autoimmunität, Unterstützung bei der B-Zellen und Plasma-Zelle Produktion von Antikörpern und Aufspüren und eliminieren von Krebszellen. Die Entwicklung von Peptid/MHC Klasse I Tetramer Färbung des Antigen-spezifische CD8 T-Zellen1 und die neuere Entwicklung der MHC Klasse II Tetramer Färbung von CD4-T-Zellen-2 durch Durchflusszytometrie revolutioniert unsere Fähigkeit zu studieren und zu verstehen, die Immunbiologie der T-Zellen. Während äußerst nützlich für die Bestimmung der Menge und der Phänotyp der antigenspezifischen T-Zellen, lässt die Durchflusszytometrie nicht für den Nachweis von räumliche Lokalisation der antigenspezifischen T-Zellen auf andere Zellen und Strukturen in den Geweben, und aktuelle Disaggregation Techniken, die T-Zellen zu extrahieren benötigt für Durchflusszytometrie Wirksamkeit in nicht-lymphatischen Gewebe3begrenzt haben.
Wir und andere entwickelten Methoden mit Peptid beladenen MHC Klasse I und Klasse II Tetramer oder Multimer Reagenzien, Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen im Gewebe4,5,6,7, beflecken 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. these IST Methoden ermöglichen die Bestimmung der Lage, die Fülle und den Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen in den Geweben und bieten eine Möglichkeit, diese Zellen im Vergleich zu anderen Zellen und Strukturen im Gewebe zu erkennen. Unsere Fraktion wird intensiv genutzt, MHC-ich Tetramer beflecken, zum studieren Human Immunodeficiency Virus (HIV)- und simian Immunodeficiencyvirus (SIV) – spezifischen CD8 T-Zellen im lymphatischen, genitalen und rektalen Gewebe um ein Verständnis von HIV und SIV Immunpathogenese und Korrelate des erfolgreichen Impfung Strategien14,15,16,17zu identifizieren. Darüber hinaus entwickelten wir auch eine Technik, die kombiniert IST mit in Situ Hybridisierung (ISH) zu lokalisieren und zu quantifizieren, Virus-spezifischen CD8 T-Zellen und Virus-infizierten Zellen in Geweben und zu bestimmen, die in Vivo -Effektor-zu-Zielwerte 18 , 19.
Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Peptid beladenen MHC-ich Tetramers Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in frischen Gewebeschnitten zu Gegenfärbung Gewebe mit IHC beflecken und Zellen mit bestimmten Phänotypen in bestimmte Gewebe Fächer zu quantifizieren. Diese Verfahren sind die gleichen wie in unseren kürzlich erschienenen Publikation von Li Et Al., verwendet wurden, in denen wir die Lage, der Fülle und der Phänotyp der SIV-spezifische T-Zellen im lymphatischen Gewebe während chronische SIV-Infektion bei Makaken20bestimmt.
Für dieses Verfahren sind frische Gewebe geschnitten und über Nacht inkubiert mit Peptid beladenen MHC-ich Tetramers konjugiert zu Fluorescein Thiocyanat Moleküle (FITC). Sie sind dann in Paraformaldehyd fixiert. Nach der Fixierung des Gewebes, ist das Signal von der MHC-Tetramers verstärkt mit Kaninchen Anti-FITC Antikörper und inkubiert mit Gewebekulturen tagged Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, die das Signal von der gebundenen Tetramers weiter zu verstärken. IHC dient in Verbindung mit IST Antigen-spezifische T-Zellen und umgebenden Zellen zu charakterisieren. Antikörper, die Epitope auf der Oberfläche von Zellen oder in den Extrazellulärraum zu erkennen sind in der primären Inkubation mit dem Tetramers enthalten. Antikörper, die intrazellulären Epitope erkennen erfordern Durchdringung der Zellwand vor dem beflecken. Die gefärbten Gewebeschnitten sind abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop und mittels konfokale Software analysiert. Markierte Zellen werden mit der konfokalen Mikroskopie Software oder ImageJ quantifiziert. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um im wesentlichen Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in jedem Gewebe für die MHC färben-ich Tetramers stehen zur Verfügung.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST in Kombination mit IHC stellt ein wesentliches Instrument für die Erkennung, Charakterisierung und Quantifizierung der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in nativen Umgebungen mit dem Kontext von anderen Zellen und Gewebestrukturen. Hier beschrieben wir detaillierte Verfahren für IST kombiniert mit IHC, gefolgt von quantitativen Bildanalyse zu bestimmen, die Lage, die Fülle und den Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in den Lymphknoten von Rhesus-Makaken. Ähnliche Färbung kann für Mensch, Maus oder and…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Riferimenti
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