In Situ MHC-tetramer flekker og kvantitativ analyse for å fastslå plasseringen, overflod og fenotypen av Antigen-spesifikke CD8 T celler i vev
Summary
Her beskriver vi en metode som kombinerer i situ MHC-tetramer flekker med immunohistochemistry å bestemme lokaliseringen, fenotype, og antallet av antigen-spesifikke T-celler i vev. Denne protokollen brukes til å angi romlige og fenotypiske kjennetegn av antigen-spesifikke CD8 T-celler i forhold til andre celle type og strukturer i vev.
Abstract
T-celler er avgjørende for mange immunologiske prosesser, inkludert oppdage og fjerne virus-infiserte celler, forebygge autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produksjon av antistoffer, og oppdage og eliminere kreftceller. Utviklingen av MHC-tetramer farging av antigen-spesifikke T-celler analysert av flowcytometri har revolusjonert vår evne til å studere og forstå immunobiology av T-celler. Mens det er svært nyttig for å bestemme antall og fenotypen av antigen-spesifikke T-celler, kan ikke flowcytometri bestemme den romlige lokaliseringen av antigen-spesifikke T-celler til andre celler og strukturer i vev, og gjeldende disaggregation teknikker for å ekstra T nødvendig celler for flowcytometri har begrenset effektivitet i ikke-lymfoid vev. In situ MHC-tetramer flekker (IST) er en teknikk for å visualisere T-celler som er spesifikke for antigener rundt i vev. I kombinasjon med immunohistochemistry (IHC), kan IST bestemme overflod, plasseringen og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev. Her beskriver vi en protokoll for flekken og nummerere antigen-spesifikke CD8 T celler, med bestemte fenotyper innenfor bestemte vev avdelinger. Disse prosedyrene er det samme som vi brukt i våre siste publikasjon av Li et al., med tittelen “Simian immunsviktvirus-produserende celler i hårsekkene er delvis undertrykt CD8+ celler i Vivo.” Metodene beskrevet er bredt aktuelt fordi de kan brukes til å lokalisere, fenotype, og kvantifisere i hovedsak en antigen-spesifikke CD8 T celle som MHC tetramers er tilgjengelige, i alle typer vev.
Introduction
T-celler er avgjørende for mange immunologiske prosesser, inkludert oppdage og fjerne virus-infiserte celler, forebygge autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produksjon av antistoffer, og oppdage og eliminere kreftceller. Utviklingen av peptid/MHC klasse I tetramer farging av antigen-spesifikke CD8 T celler1 og nyere utviklingen av MHC klasse II tetramer farging av CD4 T celler2 av flowcytometri revolusjonerte vår evne til å studere og forstå den immunobiology av T-celler. Mens det er svært nyttig for å bestemme antall og fenotypen av antigen-spesifikke T-celler, tillater flowcytometri ikke påvisning av den romlige lokaliseringen av antigen-spesifikke T-celler til andre celler og vev, og gjeldende Disaggregation teknikker for å trekke ut de T-cellene trengs for flowcytometri har begrenset effektivitet i ikke-lymfoid vev3.
Vi og andre har utviklet ved hjelp av peptid-lastet MHC, klasse I og klasse II tetramer eller multimer reagenser stain antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse IST metoder tillater fastsetting av plasseringen, overflod og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev og gir en måte å oppdage disse celler i forhold til andre celler og strukturer i vev. Vår gruppe har mye brukt MHC-jeg tetramer flekker for å studere humant immunsviktvirus (HIV)- og simian immunsviktvirus (SIV) – spesifikke CD8 T celler i lymfoide, genital og endetarms vev å få en forståelse av HIV og SIV immunopathogenesis og for å identifisere korrelerer vellykket vaksinasjon, strategier,14,,15,,16,,17. Dessuten, utviklet vi også en teknikk som kombinerer IST med i situ hybridisering (ISH) å lokalisere og kvantifisere virus-spesifikke CD8 T celler og virus-infiserte celler i vev og bestemme i vivo effektor til mål nivåer 18 , 19.
Her beskriver vi en protokoll som peptid-lastet MHC-jeg tetramers stain antigen-spesifikke CD8 T celler i ferskt vev deler, til counterstain vev bruker IHC og kvantifisere celler med bestemte fenotyper i bestemte vev avdelinger. Disse prosedyrene er det samme som ble brukt i våre siste publikasjon av Li et al., der vi bestemt plasseringen, overflod og fenotypen av SIV-spesifikke T celler i lymfoidvev under kronisk SIV infeksjon i aper20.
Til dette friskt vev er delt og ruges natten med peptid-lastet MHC-jeg tetramers konjugert til fluorescein thiocyanate molekyler (FITC). De er så fast i paraformaldehyde. Etter festing vevet, forsterkes signalet fra MHC-tetramers bruker kanin anti-FITC antistoffer og inkubert med fluorescently merket anti-kanin IgG antistoffer, som ytterligere forsterke signalet fra de bundne tetramers. IHC brukes i forbindelse med IST for å karakterisere antigen-spesifikke T celler og omkringliggende celler. Antistoffer som gjenkjenner epitopes på overflaten av celler eller ekstracellulær inn er inkludert i den primære inkubering med tetramers. Antistoffer som anerkjenner intracellulære epitopes krever gjennomtrengning av cellen vegg før flekker. Delene farget vev er fotografert ved hjelp av en AC confocal mikroskop og analysert ved hjelp av AC confocal programvare. Merket cellene er kvantifisert bruker AC confocal mikroskopi programvare eller ImageJ. Beskrevet protokollen kan brukes til å flekken i hovedsak en antigen-spesifikke CD8 T celle i alle typer vev for hvilke MHC-jeg tetramers er tilgjengelige.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST kombinert med IHC gir et viktig verktøy for oppdage karakterisere og kvantifisere antigen-spesifikke CD8 T celler i innfødte miljøer med konteksten av andre celler og vev strukturer. Her beskrevet vi detaljerte fremgangsmåter for IST kombinert med IHC, etterfulgt av kvantitative bildeanalyser, for å avgjøre plasseringen, overflod og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 T celler i lymfeknutene fra rhesus aper. Lignende flekker kan brukes på menneskelig, mus eller andre arter vev for hvilke MHC-jeg tetramers er t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av helsevesenet tilskudd fra National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Riferimenti
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
