संवहनी नियंत्रण चूहों के पृथक प्रतिरोध धमनियों के वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग तंत्र का मूल्यांकन
Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन इन विट्रो में चूहे मस्तिष्क प्रतिरोध धमनियों में संवहनी समारोह के मूल्यांकन के लिए वीडियो माइक्रोस्कोपिक प्रोटोकॉल । पांडुलिपि भी फ्लोरोसेंट लेबल लेक्टिन और ऊतक छिड़काव लेजर डॉपलर Flowmetry का उपयोग कर के साथ microvessel घनत्व के मूल्यांकन के लिए तकनीक का वर्णन ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का उपयोग इन विट्रो टेलीविजन माइक्रोस्कोपी का वर्णन करने के लिए अलग मस्तिष्क प्रतिरोध धमनियों (और अन्य जहाजों) में संवहनी समारोह का मूल्यांकन, और लेजर डॉपलर Flowmetry का उपयोग कर ऊतक छिड़काव के मूल्यांकन के लिए तकनीकों का वर्णन (एलडीएफ ) और microvessel घनत्व का उपयोग फ्लोरोसेंट लेबल Griffonia simplicifolia (GS1) लेक्टिन । transmural दबाव पर अलग प्रतिरोध धमनियों का अध्ययन करने के लिए वर्तमान तरीके vivo में सामना करना पड़ा और parenchymal सेल के प्रभाव के अभाव में vivo में अध्ययन और आणविक से प्राप्त जानकारी के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी प्रदान गुटबंदी दृष्टिकोण है कि पूरे पशु स्तर पर एकीकृत प्रतिक्रियाओं में सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । एलडीएफ और तकनीक चुनिंदा धमनियों और केशिकाओं की पहचान करने के लिए फ्लोरोसेंट-लेबल GS1 लेक्टिन व्यावहारिक समाधान प्रदान करने के लिए जांचकर्ताओं अलग प्रतिरोध धमनियों के अध्ययन से प्राप्त ज्ञान का विस्तार करने के लिए सक्षम करें । यह कागज इन तकनीकों के आवेदन का वर्णन करने के लिए एक सामांय प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में चूहे में संवहनी शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के मौलिक ज्ञान प्राप्त है, और विशेष आनुवंशिक रूप से इंजीनियर “डिजाइनर” चूहे उपभेदों कि प्रदान कर सकते है की एक किस्म में महत्वपूर्ण संवहनी phenotypes पर विशिष्ट जीन के प्रभाव में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि । चूहे में इन मूल्यवान प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग चयनात्मक प्रजनन रणनीतियों और चूहे में जीन नॉकआउट मॉडल के उत्पादन के लिए नई प्रौद्योगिकियों द्वारा विकसित, वैज्ञानिक नॉकआउट माउस मॉडल में विकसित परिसर की कठोरता का विस्तार होगा और एक और अधिक प्रासंगिक पशु मॉडल के लिए है कि ज्ञान का विस्तार, क्योंकि इसके बड़े आकार के शारीरिक अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से समझा शारीरिक पृष्ठभूमि और उपयुक्तता के साथ ।
Introduction
धमनियों में संवहनी समारोह के प्रारंभिक अध्ययनों नाली धमनियों का उपयोग, और कई मामलों में महाधमनी. बड़ी धमनियों में बल पीढ़ी आम तौर पर एक ऊतक स्नान में एक बल transducer करने के लिए धमनी की एक अंगूठी खंड संलग्न द्वारा अध्ययन किया गया था; महाधमनी के मामले में, पोत के पेचदार स्ट्रिप्स काटने से इतना है कि चिकनी मांसपेशी फाइबर लगाव के बिंदु और बल transducer के बीच एक अनुदैर्ध्य दिशा में उंमुख थे, के संकुचन द्वारा उत्पंन बल का सबसे अच्छा अनुमान प्रदान करने के लिए इसके अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ चिकनी मांसपेशी । aortas के पेचदार स्ट्रिप्स को काटने के लिए मानक तकनीक पोत के लुमेन में एक गिलास रॉड जगह थी, इच्छित कोण पर पोत दीवार में कटौती करने के लिए, और पोत दीवार के उजागर किनारे के अंत करने के लिए पर पकड़ के रूप में कटौती के लिए एक पूरा उत्पादन बढ़ाया गया था पोत की पेचदार पट्टी । उस समय, पोत के endothelial पक्ष आम तौर पर blotted बल transducer के लिए पोत पट्टी संलग्न करने और एक oxygenated और तापमान नियंत्रित ऊतक स्नान में तैयारी के विलय से पहले मलबे को हटाने के लिए किया गया था । अंत में, कि दृष्टिकोण Furchgott और Zawadski द्वारा फिजियोलॉजी के इतिहास में सबसे प्रसिद्ध और महत्वपूर्ण खोजों में से एक के नेतृत्व में1, अर्थात् endothelium व्युत्पंन आराम कारक (EDRF), बाद में नाइट्रिक ऑक्साइड के रूप में की पहचान की भूमिका, में संवहनी समारोह को विनियमित. महत्वपूर्ण है कि खोज के लिए अग्रणी घटना एक स्थिति में जांचकर्ताओं विदेशी सतहों के साथ धमनी के endothelial पक्ष के संपर्क से बचने के द्वारा एक बरकरार endothelium बनाए रखा था, और देखा कि महाधमनी पट्टी की उंमीद प्रदर्शन नहीं किया acetylcholine (पीटीएच) के लिए संकुचन, लेकिन बजाय के जवाब में आराम से । उस अवलोकन के आधार पर, जांचकर्ताओं एक “सैंडविच” तैयारी जिसमें वे एक बरकरार endothelium के साथ एक महाधमनी खंड संलग्न विकसित (लेकिन सिकुड़ा बल उत्पंन करने में असमर्थ) महाधमनी के एक मानक पेचदार पट्टी के लिए और में परिवर्तित कर दिया–प्रेरित एक छूट में संकुचन ।
इस क्षेत्र है कि बड़े पैमाने पर आज उपयोग किया जाता है में दो प्रमुख अग्रिम तैयारियों के विकास के लिए छोटे प्रतिरोध धमनियों में सक्रिय सिकुड़ा बल2,3 (जैसे आंतों अन्त्रपेशी 3 में उन के रूप में ) और cannulated प्रतिरोध धमनी की तैयारी4,5,6. प्राचीनतम रिपोर्टों में से एक में, Mulvany और Halpern3 में सहज अन्त्रपेशी चूहों (ग्रस्त) के आंतों SHR से पृथक प्रतिरोध धमनियों में सक्रिय सिकुड़ा बल का अध्ययन करने के लिए तार myograph तैयारी के उपयोग का वर्णन किया गया है और normotensive WKY नियंत्रण होते. तार myograph प्रणाली के विकास के बाद, cannulated प्रतिरोध धमनी की तैयारी के लिए जहाजों के अध्ययन की अनुमति के लिए करीब vivo शर्तों4,5,6 में विकसित किया गया । जबकि दोनों दृष्टिकोण मूल्यवान परिणाम प्रदान करते हैं, cannulated धमनी तैयारी अधिक प्रभावी ढंग से धमनियों में आंतरिक सक्रिय टोन के संरक्षण के अतिरिक्त लाभ है; और जांचकर्ताओं को transmural दबाव और पोत प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन करने के लिए सक्रिय myogenic प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रवाह की दर और endothelial कतरनी तनाव में परिवर्तन की अनुमति (Halpern और Kelley द्वारा समीक्षा देखें6) ।
वर्तमान कागज का एक प्रमुख लक्ष्य का वर्णन कैसे समय-वीडियो माइक्रोस्कोपी के संमानित तकनीक का उपयोग करने के लिए अलग, cannulated प्रतिरोध धमनियों में आदेश सटीक तंत्र है कि इन महत्वपूर्ण में सक्रिय टोन को विनियमित के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए काम करने के लिए है जहाजों, तंत्रिका, विनोदी, या parenchymal सेल प्रभाव से स्वतंत्र । यह बुनियादी जानकारी, एक मानक चूहे मॉडल और उदाहरण के नए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे उपभेदों के हमारे अध्ययन से रोजगार, संवहनी समारोह है कि टेलीविजन के साथ प्राप्त किया जा सकता है के बारे में अंतर्दृष्टि के प्रकार के एक विचार के साथ पाठक प्रदान करेगा सूक्ष्म दृष्टिकोण, और जो किसी भी नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूह (ओं) को शामिल करने के अध्ययन में नियोजित किया जा सकता है अंवेषक का चयन, शक्तिशाली नए प्रयोगात्मक चूहे चयनात्मक द्वारा उत्पादित मॉडल सहित और नए आनुवंशिक विकसित इंजीनियरिंग तकनीक ।
टीवी माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण की परिशुद्धता के लिए धन्यवाद, cannulated धमनी की तैयारी में व्यास परिवर्तन की माप अत्यधिक मूल्यवान endothelium के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं-निर्भर और endothelium-संवहनी स्वतंत्र तंत्र विश्राम, के रूप में अच्छी तरह के रूप में महत्वपूर्ण (और कई बार अप्रत्याशित) उच्च रक्तचाप, उच्च नमक आहार, और अंय प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के साथ होने वाली संवहनी नियंत्रण तंत्र में परिवर्तन । इसके अलावा, अलग और cannulated प्रतिरोध धमनियों में दबाव व्यास संबंधों की माप है कि अधिक से अधिक सीए के साथ उपचार द्वारा आराम कर रहे हैं2 +-मुक्त समाधान या एक औषधीय vasodilator दवा, अंवेषक का आकलन करने की अनुमति देता है संवहनी remodeling के कारण धमनियों में संरचनात्मक परिवर्तन और निष्क्रिय तनाव की गणना करने के लिए7 कि धमनियों के निष्क्रिय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि धमनियों समारोह को प्रभावित कर सकते हैं स्वतंत्र के (या इसके अलावा में) सक्रिय नियंत्रण तंत्र में परिवर्तन । यह भी ध्यान रखें कि जानकारी अलग प्रतिरोध धमनियों के अध्ययन से प्राप्त की जानकारी के द्वारा पूरक किया जा सकता है महत्वपूर्ण है, पूरे पशु स्तर8पर ऊतक छिड़काव के मूल्यांकन के लिए एक व्यावहारिक विधि का उपयोग एलडीएफ,9 ,10, और जानकारी के द्वारा फ्लोरोसेंट लेबल GS1 लेक्टिन, जो विशेष रूप से छोटे moieties और केशिकाओं11 की तहखाने झिल्ली में ग्लाइकोप्रोटीन धमनियों को बांध का उपयोग कर microvessel घनत्व का आकलन करने से प्राप्त , 12. उत्तरार्द्ध विधि microvessel घनत्व का एक बहुत सटीक अनुमान है कि क्लासिक कठिनाइयों के अधीन नहीं है प्रदान करता है vivo मेंजहाजों की गिनती से microvessel घनत्व का आकलन करने में सामना करना पड़ा, उदाहरण के लिए गैर लापता-perfused जहाजों जहां रक्त प्रवाह धमनियों के सक्रिय बंद होने के कारण बंद कर दिया है । जब एक साथ इस्तेमाल किया, इन तरीकों microvasculature स्तर पर ऊतक छिड़काव में परिवर्तन करने के लिए अलग प्रतिरोध धमनियों में कार्यात्मक परिवर्तनों को सहसंबंधी करने के लिए महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं; और cannulated धमनी तकनीक के साथ संयोजन के रूप में उन मूल्यवान दृष्टिकोण के उपयोग के कुछ उदाहरण भी वर्तमान पांडुलिपि में प्रदान किया जाएगा ।
वर्तमान कागज वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीक के उपयोग पर केंद्रित Sprague-Dawley चूहों की धमनियों में संवहनी परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए । हालांकि, यह ध्यान दें कि इन तकनीकों को अत्यधिक विशिष्ट आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे चयनात्मक प्रजनन या जीन तकनीक का उपयोग कर संपादन के द्वारा बनाई गई उपभेदों में elucidating phenotypic परिवर्तन में अत्यधिक मूल्यवान साबित किया है महत्वपूर्ण है । इस पांडुलिपि में, हम कैसे वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीक महत्वपूर्ण Dahl नमक सहित मूल्यवान चूहे मॉडल की एक संख्या में संवहनी समारोह के बारे में जानकारी प्रदान की है के उदाहरण देते हैं, संवेदनशील (एसएस) चूहा-एक नस्ल चूहा तनाव है कि सबसे व्यापक रूप से है प्रयुक्त प्रायोगिक मॉडल नमक संवेदनशील hypertenson के तंत्र का अध्ययन करने के लिए18,19,20,21,22,23; और consomic चूहों नमक असंवेदनशील ब्राउन नॉर्वे (बीएन) चूहे तनाव के साथ एसएस चूहों के चयनात्मक प्रजनन के माध्यम से बनाया । consomic चूहा पैनलों में, ब्राउन नॉर्वे चूहे से हर गुणसूत्र Dahl एसएस24,25,26 आनुवंशिक पृष्ठभूमि में व्यक्तिगत रूप से introgressed किया गया है । consomic चूहे पैनलों का उपयोग विशिष्ट गुणसूत्रों कि रक्तचाप और संवहनी जेट सहित अन्य phenotypes के नमक संवेदनशीलता में योगदान के बारे में बहुमूल्य सुराग प्रदान की गई है24,25,26 ,27,28.
चयनात्मक प्रजनन रणनीति एसएस चूहों और consomic व्यक्तिगत बीएन गुणसूत्रों ले जाने चूहों का उपयोग भी Dahl एसएस आनुवंशिक में व्यक्तिगत भूरे रंग नॉर्वे गुणसूत्रों के छोटे खंडों के साथ संकुचित congenic उपभेदों की पीढ़ी को सक्षम किया है पृष्ठभूमि22,29। ये विशिष्ट जीन या गुणसूत्रों के संकीर्ण क्षेत्रों है कि ऐसे रक्तचाप, गुर्दे की क्षति के रूप में महत्वपूर्ण शारीरिक चर, को प्रभावित कर सकते है पर अत्यंत मूल्यवान इनपुट प्रदान कर सकते हैं, और संवहनी जेट22,29। चूहे के लिए एक और शक्तिशाली इसके अलावा आनुवंशिक toolbox चूहा जीन नॉकआउट मॉडल ZFNs सहित उंनत जीन संपादन तकनीक का उपयोग, transcriptional उत्प्रेरक की तरह-प्रभाव nucleases (TALENS), और सबसे हाल ही में CRISPR-Cas9 13 के विकास है ,14,15,16,17. इन शक्तिशाली तकनीक के आगमन कि जीन को सक्षम करने के लिए चूहे में दस्तक दी हो एक बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि जीन पीटकर अध्ययन तिथि करने के लिए इस्तेमाल किया है (और उपयोग करने के लिए जारी) लगभग विशेष रूप से चूहों । वर्तमान कागज में एक और प्रयोगात्मक घटक cannulated धमनी तकनीक और वीडियो माइक्रोस्कोपी के मूल्य को पीटकर चूहों में शारीरिक नियंत्रण तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए मास्टर एंटीऑक्सीडेंट और सेल सुरक्षात्मक प्रतिलेखन की कमी दर्शाता है कारक, नाभिकीय कारक (erythroid-व्युत्पंन 2)-जैसे-2 (NRF2)30,31, जो Sprague-Dawley आनुवंशिक पृष्ठभूमि17में तलेन प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विकसित किए गए थे । उन प्रयोगों में, इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीकों में NRF2 जीन की हानि के कार्यात्मक सत्यापन प्रदान करने के लिए और एक संभावित मूल्यवान चिकित्सीय NRF2 के प्रत्यक्ष विनियमन के आधार पर मध्यस्थता एंटीऑक्सीडेंट का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया ठोंकी. एनआरएफ-2 मानव में combatting संवहनी oxidative तनाव में पर्याप्त चिकित्सीय महत्व का है, नैदानिक विटामिन सी और ई३२जैसे antioxidants के प्रत्यक्ष प्रशासन को शामिल परीक्षणों के निराशाजनक परिणाम के प्रकाश में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, इस कागज टीवी माइक्रोस्कोपी और पृथक प्रतिरोध धमनी का उपयोग करने के लिए मानक चूहे मॉडल में ही नहीं संवहनी समारोह का मूल्यांकन दृष्टिकोण का वर्णन (के रूप में वीडियो में…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पांडुलिपि की तैयारी में अपनी अमूल्य सहायता के लिए केटी फिंक और लिन Dondlinger को अपनी भावभीनी धन्यवाद व्यक्त करते हैं ।
अनुदान सहायता: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; और #R01-HL128242 ।
Materials
| SS Rat | Medical College of Wisconsin | SS/JHsd/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.5BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 5BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.13BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 13BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-BN Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSA Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSB Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates | Medical College of Wisconsin | SD-Nfe212em1Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113755 | |
| High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113756 | |
| Colorado Video Caliper | Colorado Video, Inc. | Model 308 | |
| Video Camera | Hitachi | KPM1AN | |
| Microscope | Olympus Life Science | CKX41 | |
| Television Monitor | Panasonic | WVBM1410 | |
| Pressure Transducers | Stoelting | 56360 | |
| Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
| Cannulated Artery Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | Single vessel chamber for general use |
| Temperature Controller for Single Chamber | Living Systems Instrumentation | TC-09S | |
| Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight | Living Systems Instrumentation | GD-MS | Provides aeration in the vessel bath |
| Gas Exchange Oxygenator, Miniature | Living Systems Instrumentation | OX | Allows gas exchange with perfusate |
| Laser-Doppler Flowmeter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| GS1 Lectin | Vector Labs | RL-1102 | |
| Glass Capillary Tubes for Micropipettes | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm ID |
| Verticle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Nylon suture material (10/0)-3 PLY | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Protandim | Protandim | NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-3 | |
| Dextrose (d-glucose) anhydrous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
| Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
| Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | ED255-500G |
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