Bu el yazması sıçan beyin direnç arterlerin vasküler işlevinde değerlendirilmesinde vitro video mikroskobu iletişim kurallarını açıklar. El yazması da microvessel yoğunluğu fluorescently etiketli lektin ve doku perfüzyon lazer Doppler Flowmetry kullanarak değerlendirmek için teknikler açıklanır.
Bu iletişim kuralı vitro televizyon mikroskobu damar fonksiyonu izole beyin direnç arterler (ve diğer gemilerin) değerlendirmek için kullanımını açıklar ve lazer Doppler Flowmetry (LDF kullanarak doku perfüzyon değerlendirmek için teknikler açıklanır ) ve microvessel yoğunluğu fluorescently kullanan etiketli griffona simplicifolia (GS1) lektin. Eğitim için geçerli yöntemleri direnç arterler transmural basınç karşılaştı vivo içinde izole ve parenkimal hücre etkileri yokluğunda in vivo çalışmalar ve moleküler üzerinden elde edilen bilgilerden arasında önemli bir bağlantı sağlamak Bütün hayvan düzeyinde bütünleştirici yanıt sınırlı içgörü sağlamak indirgemeci yaklaşımlar. LDF ve teknikleri ile GS1 lektin fluorescently etiketli arteriyoller ve kılcal seçmeli olarak tanımlamak için izole direnç arterler çalışmalardan elde bilgi genişletmek müfettişler etkinleştirmek için pratik çözümler sunuyor. Bu kağıt vasküler Fizyoloji ve genel bir deneysel model olarak fare patolojisi temel bilgi elde etmek için bu tekniklerin uygulanması açıklar ve özel çeşitli genetik olarak sağlayabilir “tasarımcı” sıçan suşları belirli genler etkisi önemli vasküler fenotipleri önemli içgörü. Sıçan suşları seçici üreme stratejileri ve rat, gen nakavt modellerinde üretimi için yeni teknolojiler tarafından geliştirilen bu değerli deneysel yaklaşımlar kullanarak bilimsel tesislerinde nakavt fare modellerinde geliştirilmiş rigor genişletmek ve Bu bilgi için bir iyi anlaşılan fizyolojik arka plan ve uygunluğu daha büyük boyutu nedeniyle fizyolojik Etütler ile daha alakalı bir hayvan modeli genişletir.
Vasküler işlevi arterler kullanılan boru arterler ve pek çok erken çalışmaların aort durumda. Büyük arterler kuvvet oluşturma genellikle bir doku banyoda bir güç çevirici için bir yüzük kesimi arter ekleyerek incelenmiş; düz kas lifleri eki noktası ve daralma tarafından oluşturulan gücünün en iyi tahmin sağlamak için güç dönüştürücü arasındaki boyuna yönde odaklı böylece aorta durumunda kesme Helisel gemisini şeritler düz kas boyuna ekseni boyunca. Aortas Helisel şeritler kesme için standart teknik bir cam çubuk gemi Lümen içinde yer, istenen açıda damar duvarındaki bir kesim yapmak ve kesme gruplandırırken üretmek için genişletildi maruz damar duvar kenarına sonuna kadar basılı tutun yapıldı. gemi Helisel şerit. Bu noktada, damar endotel tarafında genellikle gemi strip güç dönüştürücü ekleyerek ve bir oksijenli hazırlanmasında batış önce enkaz kaldırmak için deyimiyle ve doku banyo ısı kontrollü. Sonunda, daha sonra nitrik oksit tanımlanan dinlendirici faktör (EDRF), yaklaşım Furchgott ve Zawadski1, yani endotel rolü fizyolojisi, tarihinin en ünlü ve önemli keşifler birine götürdü elde edilen Vasküler işlevini düzenleyen. Bu keşif için önde gelen önemli olay hangi müfettişler bir sağlam endotel yabancı yüzeyler ile damar endotel tarafına temas kaçınarak tarafından tutulan ve aort şerit beklenen sergilemek değil olduğunu fark bir durumdu kasılma asetilkolin (ACh), ama bunun yerine rahat ACh karşılık olarak için. Bu gözleme dayalı, müfettişler hangi onlar bir aort kesimini (ama yapamaz-contractile güç oluşturmak) bir sağlam endotel ile bağlı bir “sandviç” hazırlık aort bir çift sarmal şerit için geliştirilen ve ACh kaynaklı dönüştürülür kasılma bir rahatlama içine.
Bugün yaygın olarak kullanılır Bu alanda iki önemli gelişmeler vardır küçük direniş arterler2,3 ‘ te etkin contractile kuvvet ölçmek için hazırlıklar gelişimi (örneğin bağırsak bıçaklanmasından3 ) ve cannulated direnç arter hazırlıklar4,5,6. Bir erken raporları, Mulvany ve Halpern3 etkin contractile güç izole direnç arterler gelen kendiliğinden hipertansif sıçan (SHR) bağırsak bıçaklanmasından olarak çalışmaya tel myograph hazırlık kullanımı açıklanmıştır ve normotansif WKY kontrol eder. Tel myograph sisteminin geliştirilmesi sonraki cannulated direnç arter hazırlıklar çalışmalar damarlarının daha yakın vivo içinde koşullar4,5,6için izin vermek için geliştirilmiştir. Her iki yaklaşımın değerli sonuçlar sağlarken, cannulated arter hazırlık daha etkili koruma arterlerde içsel etkin sesi ekledi avantajı vardır; ve Müfettişler transmural basınç ve gemi yanıt-e doğru akış hızı ve endotel kesme stres değişiklikleri değişiklikleri active myogenic yanıt çalışmaya izin (bkz: adli kullanici tarafindan goruntulendi Halpern ve Kelley6).
Mevcut kağıt ana amacı bu önemli etkin sesi düzenleyen mekanizmalar ile ilgili kesin bilgi elde etmek için izole, cannulated direnç arterler kullanarak video mikroskobu onur tekniği kullanırım nasıl tarif etmektir damarlar, sinir, humoral veya parenkima hücre etkileri bağımsız. Bu temel bilgi, yeni bir standart fare modeli ve bizim çalışmaları örneklerden genetik olarak istihdam sıçan suşları mühendislik, okuyucu ile televizyon elde edilebilir vasküler işlevi ile ilgili yorumlara türleri hakkında bir fikir verecektir mikroskopi yaklaşımlar ve hangi herhangi bir kontrol ve araştırmacı’nın seçme, deneysel grupları içeren çalışmalarda istihdam seçici akraba evliliği tarafından üretilen ve yeni genetik geliştirilmiş güçlü yeni deneysel fare modelleri de dahil olmak üzere mühendislik teknikleri.
Televizyon mikroskobu yaklaşımlar duyarlığını sayesinde, cannulated arter hazırlıklar değişimler çapı ölçümü vasküler endotel bağımlı ve endotel bağımsız mekanizmaları ile ilgili çok değerli bilgi sağlayabilir gevşeme yanı sıra hipertansiyon, yüksek tuz diyet ve deneysel diğer müdahaleler ile meydana gelen vasküler kontrol mekanizmalarının önemli (ve bazen beklenmeyen) değişiklik. Buna ek olarak, basınç-çapı ilişkilerde ölçümü izole ve cannulated tedavi ile Ca2 +tarafından sonuna kadar rahat direniş arterler-ücretsiz çözüm veya farmakolojik vazodilatör uyuşturucu değerlendirmek için Dedektif sağlar arterlerin vasküler remodeling nedeniyle ve Arteryel işlevini etkileyebilir arterler pasif mekanik özelliklerindeki değişiklikler önemli içgörü sağlayabilir pasif stres gerginlik ilişkiler7 hesaplamak için yapısal değişiklikler bağımsız olarak (veya ek olarak) aktif kontrol mekanizmaları değiştirir. İzole direnç arterler çalışmalardan elde edilen bilgilerden LDF, doku perfüzyon bütün hayvan düzey8,9 değerlendirmek için pratik bir yöntem kullanarak elde ettiği bilgileri tarafından desteklenebilir unutmamak önemlidir ,10, ve microvessel yoğunluğu fluorescently etiketli GS1 lektin kullanılarak değerlendirme elde edilen bilgilerden tarafından özel olarak hangi bağlar küçük arteriyoller ve kılcal11 membran glikoprotein moieties için , 12. ikinci yöntemi damarları vivo içindeörneğin sigara periosteum eksik, sayarak microvessel yoğunluk tahmini yaparken karşılaşılan klasik zorluklar tabi değildir microvessel yoğunluğu son derece doğru bir tahmin sağlar damarlarının kan akımı arteriyoller etkin kapatılması nedeniyle durduğu. Birlikte kullanıldığında, bu yaklaşımların izole direnç arterler doku perfüzyon microcirculatory düzeyinde değişiklikler için fonksiyonel değişiklikler ilişkilendirmek için önemli bilgiler sağlayabilir; ve bu değerli yaklaşımlar cannulated arter teknikleri ile birlikte kullanımı, bazı örnekler de içinde mevcut el yazması sağlanacaktır.
Mevcut kağıt outbred Sprague-Dawley Rat arterlerin vasküler değişiklikler değerlendirmek için video mikroskobu teknikleri üzerinde duruluyor. Ancak, bu teknikleri alanında son derece uzman genetiği sıçan suşları seçici ıslahı veya gen teknikleri kullanarak düzenleme tarafından oluşturulan fenotipik değişiklikler elucidating çok değerli olduğu kanıtlanmıştır unutmamak gerekir. Bu makale, biz nasıl video mikroskobu teknikleri örnekleri modelleri, en yaygın Dahl tuz-duyarlı (SS) doğuştan rat sıçan bir gerginlik de dahil olmak üzere değerli sıçan çeşitli damar fonksiyonu ile ilgili önemli bilgi vermişlerdir sağlar deneysel model tuz hassas hypertenson18,19,20,21,22,23mekanizmaları incelemek için kullanılır; ve SS sıçan tuz-duyarlı Brown Norveç (BN) fare zorlanma ile seçici ıslahı yoluyla oluşturulan consomic sıçanlar. Consomic fare panelleri her kromozom Dan Brown Norveç sıçan introgressed tek tek Dahl SS24,25,26 genetik arka plana olmuştur. Consomic fare paneller kullanımı ile ilgili kan basıncı ve vasküler reaktivite24,25,26 da dahil olmak üzere diğer fenotipleri tuz duyarlılığını katkıda belirli kromozomlar değerli ipuçları sağlamıştır ,27,28.
Seçici üreme stratejileri kullanmak SS fareler ve bireysel BN kromozomu taşıyan consomic fareler de genetik Dahl SS içine bireysel Brown Norveç kromozomlar introgressed küçük parçalarla daralmış congenic suşları nesil etkinleştirdiyseniz arka plan22,29. Bunlar son derece değerli giriş üzerinde belirli genler sağlamak veya tansiyon, böbrek hasarı ve vasküler reaktivite22,29gibi çok önemli fizyolojik değişkenler etkileyebilir kromozomlar bölgelerinde daraltabilirsiniz. Bir diğer güçlü yanı sıra sıçan genetik araç kutusu sıçan gene nakavt modelleri düzenleme teknikleri ZFNs, transkripsiyon harekete geçirmek-gibi-efektör enzimler (TALENS), dahil olmak üzere Gelişmiş gen kullanan bir gelişmedir ve en son CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Gen nakavt çalışmalar bugüne kullanılan (ve kullanmaya devam) fareler içinde sıçan nakavt genler etkinleştirmek bu güçlü teknikleri gelişiyle son derece önemli bir gelişme çünkü neredeyse sadece. Bugünkü gazetede başka bir deneysel bileşeni cannulated arter teknikleri ve fizyolojik kontrol mekanizmalarını ana antioksidan ve hücre koruyucu transkripsiyon eksik nakavt Sıçanlarda değerlendirmek için video mikroskobu değerini gösterir faktör, nükleer faktör (erythroid elde edilen 2) – gibi – Sprague-Dawley genetik arka plan17‘ TALEN teknolojisi kullanılarak geliştirilen 2 (NRF2)30,31. Bu deneylerin vitro video mikroskobu teknikleri NRF2 gen kaybı fonksiyonel doğrulama sağlamak için ve potansiyel olarak değerli bir tedavi yaklaşımı NRF2-aracılı antioksidan doğrudan upregulation üzerinde dayalı test etmek için kullanılmıştır Savunma. NATO Mukabele Gücü 2 mücadele vasküler oksidatif stres insanlarda klinik çalışmalarda antioksidan vitamin C ve E32gibi doğrudan yönetimi ile ilgili hayal kırıklığı yaratan sonuçlar ışığında önemli terapötik önemi var.
Giriş bölümünde de belirtildiği gibi bu kağıt televizyon mikroskobu açıklar ve izole direnç arter sadece standart fare modelleri (istihdam video gibi) vasküler işlevin yaklaşımlar, ama aynı zamanda son derece genetik olarak uzmanlaşmış roman ve bu yaklaşımları kullanarak elde edilebilir anlayışlar güçlü göstermek mühendislik sıçan suşları. Etkin sesi değerlendirmek için bu güçlü teknikleri kullanımı ve pasif mekanik özellikleri küçük direniş arterlerin vasküler kontrol mekaniz…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar onların çok değerli yardımlarını bu yazının hazırlanmasında için samimi Katie Fink ve Lynn Dondlinger sayesinde hızlı.
Hibe desteği: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; ve #R01-HL128242.
SS Rat | Medical College of Wisconsin | SS/JHsd/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
SS.5BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 5BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
SS.13BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 13BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Ren1-BN Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Ren1-SSA Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Ren1-SSB Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates | Medical College of Wisconsin | SD-Nfe212em1Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113755 | |
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113756 | |
Colorado Video Caliper | Colorado Video, Inc. | Model 308 | |
Video Camera | Hitachi | KPM1AN | |
Microscope | Olympus Life Science | CKX41 | |
Television Monitor | Panasonic | WVBM1410 | |
Pressure Transducers | Stoelting | 56360 | |
Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
Cannulated Artery Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | Single vessel chamber for general use |
Temperature Controller for Single Chamber | Living Systems Instrumentation | TC-09S | |
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight | Living Systems Instrumentation | GD-MS | Provides aeration in the vessel bath |
Gas Exchange Oxygenator, Miniature | Living Systems Instrumentation | OX | Allows gas exchange with perfusate |
Laser-Doppler Flowmeter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
GS1 Lectin | Vector Labs | RL-1102 | |
Glass Capillary Tubes for Micropipettes | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm ID |
Verticle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
Nylon suture material (10/0)-3 PLY | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels |
Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Protandim | Protandim | NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-3 | |
Dextrose (d-glucose) anhydrous | Fisher Chemical | D16-500 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | ED255-500G |