자연스럽 게 여성 시리아 햄스터에 동작을 보람 있는 하는 동안 Extracellular 신경 전달 물질의 생체 내에서 변화를 측정
Summary
이 문서 내용을 사용 하 여 탄소 섬유 전극 효소 바이오 센서 기술에 자연적인 보상 행동 동안 도파민과 높은 시간 해상도와 조미료의 릴리스를 측정 하는 고정 잠재력 amperometric 녹음의 사용은 여자는 햄스터
Abstract
신경 전달 물질 방출 빠른 시간 규모를 측정 하는 능력 수 있습니다 특정 동작 또는 조작;에 연결 될 neurotransmission의 패턴을 기본 메커니즘 및 회로 elucidating에 강력한 도구입니다. 측정 하는 뇌의 거의 모든 분석을 수십 년 동안 microdialysis의 기술을 사용 하는 동안이 기법은 시간적 해상도 제한 됩니다. 또는 빠른 검색 주기적 voltammetry가 이다 일시적으로 정확 하 고 매우 민감한; 그러나,이 기술적으로 어려운 방법 관심의 분석의 electroactivity에 의존, 때문에 nonelectroactive 물질 (예를들면, 신경 전달 물질 글루타민 산 염)를 검출 하는 가능성은 제거 됩니다. 이 종이 고정 잠재적인 amperometry 및 임시 정밀 electroactive와 nonelectroactive 신경 전달 물질을 측정 하는 효소 바이오 센 싱 결합 하는 턴키 시스템의 사용을 자세히 설명 합니다. 이러한 두 가지 강력한 기술을의 페어링를 비교적 쉽게 토 닉과 phasic neurotransmission의 측정에 대 한 허용 하 고 허용 하는 동시에 여러 신경 전달 물질의 기록. 이 원고의 목표는 도파민과 조미료 neurotransmission에서 비보에 표시의 궁극적인 목표와 여성 햄스터에 자연스럽 게 보상 행동 (즉, 성적 행동)을 사용 하 여 측정 하는 과정을 설명 하는 이 분석 결과 다른 행동과 실험 패러다임 검사의 기술적 타당성
Introduction
깨어 동작 동물에서 신경 전달 물질 방출 측정 하는 능력을 허용 한다 neurotransmission는 강력한 도구를 조사 메커니즘 및 모두 기본 회로의 공간 및 시간 패턴을 가진 특정 동작을 연결 하는 연구자를 자연 그리고 실시간으로 작동 동작입니다. 역사적으로, microdialysis 뇌1의 세포 외 환경에서 모두 전기 반응과 nonreactive 물질 측정 하 고용 하고있다. 이 기술은 반 투과성 빈 섬유 막2의 팁과 작은 샤프트 구성 microdialysis 프로브를 통해 extracellular 액체에 유사한 이온 성분의 수성 해결책의 지속적인 흐름을 사용 합니다. 프로브 삽입 후 신경 전달 물질 또는 관심의 다른 analytes 수 있습니다 교차 반 투과성 막 이후 분석에 대 한 간격-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 수집 되 고 전에 수동 확산에 의해 한 일반적으로, 별도로 활용 하는 분석 화학 기술 식별, 그리고 이질적인 혼합물3구성 요소를 계량.
Microdialysis 관심의 거의 모든 분석을 측정 하는 데 사용할 수 있는 중요 한 기술 이지만, 시간적인 해상도 수십 분1,2분 순서 최대 샘플링 속도와 낮은. 빠른 스캔 주기적 voltammetry (FSCV), electroactive 종의 산화 환 원 잠재력에 의존 하는 기술 발명 extracellular 액체의 분석의 즉각적인 농도 근처 명료 수 있습니다. 간단히 (참조 로빈슨 외. 4 광범위 한 검토를 위해), 전극 인상 하 고 낮은 전압 빠른 시간 규모4에 삼각형 웨이브 패션에 적용 됩니다. 전압이 올바른 범위에 있을 때 관심의 화합물은 반복적으로 산화 고 감소. 작은 교류 전류를 생성 하는 전자의 운동에이 산화 및 감소 결과. 산화 및 감소 마이크로초에 발생 하는 화합물의 초 규모 요금 걸릴 장소를 검색 합니다. 결과에서 프로브에 의해 만들어진 배경 현재 빼서 하나 현재 플롯 각 화합물에 대 한 전압을 생성할 수 있습니다. 전압 진동의 시간 규모 알려져 있기 때문에 이러한 데이터는 현재의 시간의 함수로 계산 하 사용할 수 있습니다. 따라서, 화합물의 상대적인 농도 각 산화에 전송 되는 전자의 수와 감소 반응4알려져으로 결정 될 수 있습니다.
이 화학 특이성 및 높은 시간 해상도 확인 FSCV vivo에서화학 농도 변화를 감지 하는 강력한 기술. 그러나, 이러한 매니폴드 장점에도 불구 하 고이 기술은 광범위 한 기술적 전문성과 고가의 장비 및 설치가 필요합니다. 또한, nonelectroactive 신경 전달 물질 (예, 조미료)이이 기술을 사용 하 여 측정 될 수 없습니다. 다행히도, 이러한 발명의 상용화로 서 전기 화학5의 분야에서 기술 발전 깨어 동작 동물에서 비 electroactive 신경 전달 물질을 측정 하는 비교적 간단한 방법 소개 했다 일시적인 정밀도는 기술을 타협 하지 않고 효소 바이오 센서 기술 이라고 합니다. 이 기술은 효소 변환을 사용 관심의 nonelectroactive 신경 전달 물질의 두 개의 기판으로 적용된 가능성5에 의해 생성 되는 amperometric 산화 현재로 감지 하는 과산화 수소 electroactive 중 하나는 . 상업적으로 이용 가능한 바이오 센서 프로브 생 interferents의 기여를 경쟁적으로 줄여 관심의 analytes를 측정 선택적으로 ( 그림 1참조). 조미료, 경우 일반적인 interferent ascorbic 산 (AA)의 기여는 경쟁적으로 감소 측정된 전류에 공동 electroactive 비 하 AA를 변환 하는 센서의 활성 효소 표면 산화 효소 AA 지역화 dihydroascorbate 그리고 물입니다. 또한, 부정 청구 Nafion 폴리머 레이어 효소 레이어에서 현재 생 음이온 화합물 제외합니다.
이 같은 바이오 센서 실험 설치 프로그램 electroactive 신경 전달 물질 FSCV에서 측정할 수 있지만 대신 고정 잠재력 기록6를 사용 하 여. 진동 전압 FSCV에 적용, 달리 고정 잠재력 기록에서 전압은 유지는 산화 환 원에 관심의 분석에 대 한 잠재적인. 여러 신경 전달 물질은 압도적으로 한 신경 전달 물질 쪽으로 왜곡 하는 뇌 영역에서 동일한 산화 환 원 잠재력, 있을 수 있습니다 FSCV 보다 덜 화학적 선택적 이더라도,이 접근의 턴키 자연 화학 물질의 부족을 능가 하는 것 특이성입니다.
모두 electroactive nonelectroactive 신경 전달 물질 릴리스에 거의 실시간으로 측정 하 고 특정 행동의 이벤트와 연결할 수 수렴 신경 전달 물질 자료를 검토 하는 기회를 제공 한다. 이 원고는 응답 깨어 동작 햄스터에 자연적인 보상으로 도파민, 조미료 neurotransmission가이 시스템의 사용을 자세히 설명 합니다. 이 문서의 목표는 다른 행동과 실험 패러다임을 조사 하기 위한 그것의 타당성을 보여주는 목표와 함께 여성 햄스터에 성적인 행동 중이 신경 전달 물질 자료를 측정 하는 과정을 자세히.
햄스터는 전기 녹음에 사용 하기 위해 이상적인 모델
역사적으로, 쥐 및 쥐 모델 성적 행동의 학문에 고용 되었다 있다. 이러한 설치류 종 귀 방도 추적 하 고 궁극적으로는 여성7을 탑재 하는 남성을 유혹 하 고 호핑, 다트를 포함 하는 수많은 여성 요청 동작을 관련 된 동적 copulatory 시퀀스에 참여. 남성 (또는 질 침투 없이)에 의해 장착 기간 동안 여성에에서 종사 하는 그녀의 성적 행동 자세 ( 절곡되 나) 또한 활성 요청 동작을 다시 시작 하기 전에 몇 초 동안만 단 몇 초 지속. 이 패턴의 부동성의 짧은 기간과 interspersed 활동의 높은 수준의 구성 문제의 측정 neurotransmission 동물 행동에 대 한 문제 이다. 첫째, 운동 유물 amperometric 녹음 신경 활동에 관련 되지 않은 수 있습니다. 둘째,는 운동 특정 뇌 영역에 특정 신경 전달 물질의 출시와 함께 연결 됩니다. 예를 들어 도파민 방출 등 쪽과 복 부가8,9, psychostimulant에 따라 도파민의 microdialysis 측정을 위한 기초를 형성 했다 찾는 운동 활동 결합 되어 있다 관리10. 때문에 mos에 여성 일반적인 권유 동작어렵게 neurotransmission에 변화만 최근 공동으로 성적 행동의 명시적 구성 요소에 돌리다, t 설치류, 운동 활동의 높은 수준을 포함 하 고 10 분 성적 행동 테스트 일괄으로 표시 됩니다. 분입니다.
여성 성적인 행동의 neurochemical 프로필을 분석 하이 랩 종은 성적 행동을 동반 하는 최소한의 운전 활동을 추구. 시리아 햄스터 (Mesocricetus auratus)에 copulatory 시퀀스 neurochemical 녹음 권유 행동 일반적으로 쥐 및 쥐11본의 부족에 이상적입니다. 결과적으로, 여성 햄스터 입력 하 고 테스트 세션1210 분 중 9 분 이상을 위한 절곡 자세 유지. 여성, vivo에서 외부 운동 운동의 부족으로 남자와의 성적인 상호 작용의 구성 요소와 연관 될 수 있는 전기 녹음을 얻을 수 있습니다.
햄스터에 copulatory 관찰
소개 후에 남성 자극 동물의 테스트 챔버로, 남성 그녀의 (그림 2A)를 탑재 하기 전에 여성의 anogenital 조사 (AI)에 처음 참여 한다. 위해서 탑재 하 남성, 여성 절곡, 그녀 그녀를 다시 아치 고 장착 남성 성 기에 대 한 액세스 그녀의 음부를 얻을 수 있도록 그녀의 꼬리를 굴절 이라고 받아들이는 성적 자세를 가정 합니다. 남성 여성, 두 발 (그림 2B), 그녀의 엉덩이 쪽을 clasping 탑재 하 고 성 기 수단 (그림 2C)를 얻기 위해 시도에서 밀어 시작 것입니다. 남성은 뿐만 아니라 여러 번 결국 루를 달성 하기 전에 intromit 마운트 (삽입) 없이 여성 것입니다. 마운트 및 사정에 지도 하는 intromissions의이 시퀀스 “copulatory 시 합” 이라고 불린다. 남성은 단일 세션 내에서 여러 copulatory 복싱을 있을 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
비록 비교적 간단 하 고,이 기술을 채용 하는 경우 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 첫째, 조사의 stereotaxic 배치 정확 해야: microdialysis 샘플 조사를 둘러싼 extracellular 환경에의 더 넓은 반경, 달리이 기술은 허용 직접 접촉으로 오는 신경 전달 물질의 측정 와 조사. 둘째, 섬유의 작은 폭으로 인해 탄소 섬유 녹음의 경우 파손 발생할 수 있습니다, 그리고 신중한 주의 프로브를 삽입 해야 합니다. G…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 다니엘 한미 Matlab 코드를 실행 하는 그의 도움에 대 한 학부 및 학부 알렉스 Boettcher 행동 실험 실행에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 프로젝트는 NSF IOS 1256799 R.L.M.에 의해 및 보너스 번호 T32DA007234에서 국립 보건원의 약물 남용에 국가 학회에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
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