本议定书概述了喂养 hemipteran 的昆虫,如蚜虫等所产生的植物钙信号分析的简单方法。拟南芥转化与绿色荧光蛋白钙生物传感器 GCaMP3 允许实时在体成像的高时空分辨率的钙动力学。
钙离子预计将在与钙信号形成一个既定的植物防卫反应对微生物诱导和伤人致咀嚼昆虫,引起全身钙一部分生物相互作用的关键信号实体在植物中的信号。然而,钙在体内生物胁迫中的作用是目前尚不清楚。此协议说明基因编码钙传感器来喂食的 hemipteran 害虫检测中植物的钙信号使用。Hemipterans 如蚜虫等刺穿少量细胞与专业,拉长吸口器,使它们钙动力学研究植物面临生物胁迫,有别于伤人的响应时的理想工具。此外,荧光生物传感器革命化测量的信号分子在体内动物和植物。表达绿色荧光蛋白为基础的钙生物传感器,GCaMP3,在模式植物拟南芥中允许植物钙动力学在昆虫饲喂,以高时空分辨率的实时成像。可重复和鲁棒性的测定已采用荧光显微技术的分离 GCaMP3 叶,允许连续测定钙动力学之前、 期间和之后昆虫饲喂。这揭示了一个高度本地化快速钙海拔周围蚜在几分钟内发生的站点。议定书 》 可以适应其他生物的胁迫,如额外的昆虫种类,而拟南芥使用允许快速生成的突变体促进这一现象的分子分析。
钙 (Ca2 +) 是植物中最无处不在的信号元素之一。短暂回升胞浆 Ca2 +浓度 ([Ca2 +]cyt) 由一个复杂的下游组件网络解码和参与这两个生物和非生物胁迫1,2的答复。在 [Ca2 +]cyt的崛起是对微生物诱导,形成常见的植物防御反应3,,45一部分的第一反应。[Ca2 +]cyt的升幅,指出伤人致咀嚼昆虫,如鳞翅目昆虫6,7回应。不过的潜在作用的植物的 Ca 不探讨了2 +信号响应活生物对只有几个细胞造成损害的威胁。桃蚜蚜是构成重大的威胁到世界农业8,9,hemipteran 昆虫和 Ca2 +从细胞外空间射流见于叶布满蚜10。一种测量植物 Ca2 +的鲁棒性和可重复的方法信号虽然蚜饲料从叶子荧光的 Ca2 +传感器,用蚜虫和 GCaMP3 提供新颖的工具,对此协议概述解剖在生物交互过程中的 Ca2 +的作用。
Ca2 +-选择性微电极以前曾被用于衡量 [Ca2 +] 植物11,12。最近,成为标准化的发光和荧光的方法。这些生物传感器绑定 Ca2 +和发出的光,允许为非平行的机会,研究细胞和整个组织中的 Ca2 +互动。Ca2 +传感器可以作为染料注射或稳定生产介绍了生物传感器编码到通过变换 (即基因编码传感器) 有机体的基因组序列。后者提供的主要优点是容易在活组织中的表达和有能力的亚细胞定位13。从水母(水母) 分离的水母素蛋白是第一个基因编码的 Ca2 +传感器部署在植物14。作为一种发光蛋白,水母素不需要外部的光,避免了漂白的生色团和自体荧光15励磁。水母素已被成功地用于测量 [Ca2 +] 通量对各种刺激反应,包括温度16,病原体17,,1819、 盐强调20 21和伤人7。然而,它是相对较低的信号强度,使 [Ca2 +] 通量检测单个细胞中和从差传感器表达困难13组织处于不利地位。
Ca2 +传感器,可以发出荧光的发展补充了水母素通过允许详细亚细胞和组织水平动力学分析的 Ca2 + 。最常见的荧光传感器之一是荧光共振能量转移 (FRET)-基于 Cameleons。FRET Cameleons 由两种蛋白质,通常 CFP 和 YFP,被带进密切接触所致的 Ca2 +到 CFP YFP 链接器区域中的钙调素域绑定的构象变化。此联系人允许能量的转移从 CFP YFP,和由此产生的变化在这些荧光的荧光可以准确定量测定 [Ca2 +] 通过荧光信号从这两个比率的计算荧光团22。FRET Cameleons 均优于水母素和非比率计量的荧光染料,,因为他们较少受23蛋白质的表达水平,经常有更大的荧光产量,使细胞和亚细胞成像23。例如,FRET Cameleons 最近曾确定植物的长途 Ca2 +信号并解决这些到细胞水平24,,2526。
最近的突破与荧光 GFP 基于 Ca2 +传感器已高度敏感单-荧光 (单-FP) 生物传感器的发展。单-FP 生物传感器包括一个单一的循环排列后绿色荧光蛋白钙调素和挂钩 M13 肽与 Ca2 +绑定到钙调素,所以导致钙调素与绿色荧光蛋白介导水反应发生 GFP 作用和增加荧光灯产量27,,2829。单-FP 传感器提供几个 FRET Cameleons,包括简单的实验设计和潜在的高时间分辨率成像30的优点。虽然单-FP 传感器不能简单量化绝对 [Ca2 +] 作为 FRET 传感器,他们是优越的因为信号5,23的 Ca2 +的时空动态的分析。GCaMPs 是无疑的单-FP 传感器28之一,经历了多次修订,以加强其荧光产量、 动态范围、 Ca2 +亲和力和信号信噪比31,32,33,34.GCaMPs 已经成功应用于动物的系统,如斑马鱼运动神经元35和水果飞神经肌肉接头34。GCaMP3 的随机突变导致在其他类的单-FP 传感器,包括超灵敏 GCaMP636和 GECOs29中。GECOs 最近在拟南芥(下称拟南芥) 用于衡量 Ca2 +通 ATP、 甲壳素、 和细菌诱导 flg22 的响应。这项研究也表明 R GECO 生物传感器表现优于 FRET Cameleon YC3.6 的最大信号变化和信号噪声比5。
由于易用性、 高荧光产量和可以通过 GCaMP 生物传感器的高时间分辨率,GCaMP3 基因编码在拟南芥下花椰菜花叶病毒35S 启动子。拟南芥研究的遗传工具允许对 Ca2 +信号测定 GCaMP3 的详尽分子分析。此外,GCaMP3 传感器可以可视化下荧光显微镜,而不是昂贵的共焦系统。此协议允许对整个组织成像,必要时进行实验与活的生物胁迫。实验的设计使得35S::GCaMP3植物离体的叶片漂浮在水,以防止昆虫逃脱,限制饲喂到为特定的组织。本文所述的方法因此允许喂饲蚜在叶片 Ca2 +动力学分析导致信号响应的新型植物的表征。此方法也可用于其他生物的压力,例如额外的昆虫物种和微生物病原体,与其他植物组织,如根的工作。
在本文中描述的方法允许植物的实时分析 Ca2 +期间如昆虫饲养的生物胁迫信号转导。它演示了这种威胁的第一个植物反应之一是一个本地化 [Ca2 +]cyt海拔喂食地点周围的昆虫。通过突变体,使用此方法将允许这样的信号,是不可能的以前的分子和生理表征。在本议定书中关键的一步是确保离体的叶片不过分打扰脱离过程 (步骤 3.2) 或将昆虫转移至叶 (步 4.5) 时。考虑到当前的协议提供的 [Ca2 +]cyt ,而不是绝对的浓度的相对测量,至关重要的是,显微镜设置保持不变,整个试验。期间的投资回报率的选择与分析数据,还有人类的偏见的可能性,因此,它建议实验进行双盲。
有几个显著的优势,在与本议定书的生物胁迫期间测量 [Ca2 +]cyt 。首先,使用单个荧光荧光高产允许进行在体视显微镜,这是成本低于用共焦显微镜的成像。使用单个荧光也使数据收集和分析简单,正只是一个测量记录。此外,体视显微镜的使用允许成像的整个叶子,既然许多生物相互作用,包括植物蚜虫的相互作用,发生在大的空间尺度上,这至关重要。高时间分辨率的图像捕获可能与 GCaMP3,基于快速解除关联 Ca2 +从传感器后绑定23,30 ,荧光灯产量高,允许测量采取达每 5 s。此外,叶片检测可防止逃跑的昆虫,一个关键的限制进行这种实验研究整个植物(正在编写)的一步。离体的叶片也确保这种昆虫饲料从预定义的位置,允许动力学分析的 Ca2 +之前、 期间和之后喂养。该协议还确保类似发育阶段叶片用于分析。
本议定书的主要缺点是源于非比率计量生物传感器的使用。与单-FP 生物传感器,GFP 排放的变化可能会导致从实验变量以外 [Ca2 +]cyt,如细胞的 ph 值、 运动或生物传感器的表达水平的变化。这些问题根本不会遇到与 FRET Cameleons 期间别发愁,如能量转移到 YFP CFP 只发生在 Ca2 +绑定。改变个别荧光的荧光性质其他条件很难模仿对方变化强度的 CFP 和 YFP,并天生就用的比率计算进行规范化为许多这些测量其他光学工件23,30。这使得绝对 [Ca2 +]cyt估计与 FRET Cameleons 更可靠。因此,GCaMP3 是最好用于作为一个生物传感器测量相对 [Ca2 +]cyt,虽仍不足以检测和表征中植物5,(in preparation)生物现象。因此,有必要使用控件来显示观察到的效果是由于 Ca2 +,包括 Ca2 +-相关遗传突变体(正在编写)或药理 Ca2 +通道抑制剂如 La3 +.重要的是,单-FP 生物传感器通常显示更大的荧光产量和更大的动态范围 (即,在花期对 Ca2 +绑定增加) 比 FRET Cameleons23,这使得 GCaMP 更适合组织级成像,FRET Cameleons 则用共聚焦显微镜5,25细胞成像的有用工具。
在执行本议定书,过程中很可能需要进行故障排除,将会产生一些问题。例如,它被建议,样品中的控制 (治疗) 叶显示大 [Ca2 +]cyt海拔丢弃 (步骤 6.3)。这种瞬变最有可能是应激诱导的显微镜的结果。事实上,知道蓝色光是争取 Ca2 +信号38,,3940,41,和高强度的光也可能导致温度和渗透胁迫,这两个国家也诱发 [Ca2 +]cyt海拔21,,2542。因此,为了减少这种压力,它是重要的来进行这个试验在一个通风良好、 温度控制的房间里,避免不必要地长时间的曝光。它也是重要的是不破坏叶子过分或显微镜,防止触摸引起 [Ca2 +]cyt海拔43,,4445期间脱离。用昆虫沉降,也可能遇到问题。与蚜,昆虫不要停留在几个样品中的叶子上。这可能是防御的伤口引起,在离体的叶片46,47或由蓝灯昆虫的干扰的结果。的确,视觉在蚜被受三种感光细胞,其中包括与峰值的敏感性为 490 nm48。减少显微镜曝光和处理与护理蚜虫可能减轻痛苦并鼓励定居。
当前文章概述了议定书 》 规定到植物与昆虫相互作用的分子理解和植物对生物胁迫响应的新见解。它可实现之一的植物对昆虫饲养第一响应可视化并有助于进一步调查通过大量拟南芥的遗传资源可用。此外,此协议允许用于活着的生物,相反对提取49或诱导子50。将来,此技术可以应用到其他生物的胁迫,如额外的昆虫物种、 线虫或病原微生物,以及对非生物胁迫。也可以修改 GCaMP3 显微镜图像其他植物组织,替代 Roi 的叶,或甚至整株植物。此外,还有潜在的生物传感器是遗传ly 在其他植物中编码。因此,本文概述了议定书 》 有潜力卧底的 Ca2 +信号在一系列植物和其它物种之间的新型生物相互作用的分子基础。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢格兰特 · 卡尔德 (约翰英纳斯中心,英国) 为关于显微镜的忠告。作者还要感谢约翰英纳斯中心园艺和昆虫学部门为他们提供援助。这项工作由博士奖学金从约翰 · 英尼斯基金会 (电视) 中,从生物和约翰 · 英尼斯基金会授予 B/JJ004561/1 (T.V.,硕士,J.C.,外长,S.H.,颚和 D.S.),年工业安置从约翰 · 英尼斯中心 (文学硕士)从英国 (J.C.),JST PRESTO (手机) 与赠款小型断路器 1329723 和 IOS 1557899 从国家科学基金会 (手机和球) 生化学会了夏天奖学金。
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |