Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System
Summary
En ny generation af platforme, celle-fri transskription-oversættelse er blevet manipuleret til at konstruere biokemiske systemer i vitro gennem udførelse af genet kredsløb. I denne artikel beskriver vi, hvordan Bakteriofager, MS2, ΦΧ174 og T7, er syntetiseret fra deres genom ved hjælp af en alle E. coli celle-fri TXTL system.
Abstract
En ny generation af celle-fri transskription-oversættelse (TXTL) systemer, manipuleret til at have en større alsidighed og modularitet, leverer nye kapaciteter til at udføre grundlæggende og anvendt videnskab i reagensglas reaktioner. I det sidste årti, er celle-fri TXTL blevet en kraftfuld teknik til en bred vifte af roman tværfaglig forskning områder relateret til kvantitative og syntetisk biologi. De nye TXTL platforme er især nyttig til at konstruere og afhøre biokemiske systemer gennem udførelse af syntetisk eller naturlig gen kredsløb. In vitro TXTL har vist sig praktisk at hurtigt prototype regulerende elementer og biologiske netværk samt at sammenfatte molekylære samlesæt mekanismer findes i levende systemer. I denne artikel vil vi beskrive, hvordan smitsomme Bakteriofager, såsom MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), og T7 (dsDNA), er helt syntetiseret fra deres genom i en-pot reaktioner ved hjælp af en alle Escherichia coli, celle-fri TXTL system. Syntese af de tre coliphages kvantificeres ved hjælp af plaque assay. Vi viser, hvordan udbyttet af syntetiserede phage afhænger af indstillingerne biokemiske reaktioner. Molekylær fortrængning, emuleret gennem en kontrolleret koncentration af PLØK 8000, påvirker mængden af syntetiserede phages af ordrer af størrelser. Vi beskriver også, hvordan til at forstærke phages og hvordan til at rense deres genomer. Sæt protokoller og resultaterne præsenteres i dette arbejde bør være af interesse for tværfagligt forskere involveret i celle-fri syntetisk biologi og bioteknologi.
Introduction
I det sidste årti, er celle-fri udtryk technology manipuleret til adresse roman applikationer i emergent tværfaglig forskning områder relateret til syntetiske og kvantitative biologi. Oprindeligt brugt til at udtrykke proteiner uafhængigt af en levende organisme, er nye celle-fri TXTL systemer udviklet til både grundlæggende og anvendt videnskab1,2, udvide anvendelsesområdet for denne teknologi betydeligt. Den nye generation af TXTL platforme er designet til at være brugervenligt, mere effektiv (nå 2 mg/mL af proteinsyntesen i batch mode3), mere alsidige på niveau med transskription4og modulære for at nemt integrere roman naturlige eller syntetiske funktioner, der udvider funktionerne i eksisterende biologiske systemer5,6. Især er celle-fri TXTL systemer blevet handy for rapid prototyping af genetiske programmer som regulerende elementer eller små genetiske kredsløb7,8,9, ved at reducere design-build-testen Gennemløb og Skift til et par dage. Bemærkelsesværdigt, de nye TXTL systemer er også kan behandle store DNA programmer såsom komplet syntesen af coliphages10,11, demonstrere stærk nok forestillinger for at støtte rekonstituering af aktive genomisk DNA kodet levende enheder.
TXTL systemer præsentere mange tekniske fordele sammenlignet med traditionelle in vitro- konstruktiv biokemiske assays. Celle-fri TXTL links proces af genekspression for det endelige produkt i en reduceret og åbent miljø, i modsætning til den komplekse cytoplasma af en levende celle. TXTL bruger DNA til at rekonstruere biokemiske systemer i vitro, som med moderne DNA forsamling teknikker, er overkommelige og hurtig ud over ikke kræver kræsen protein oprensning trin. Celle-fri udtryk giver direkte adgang til de fleste af komponenterne i de biokemiske reaktioner, hvilket giver en dybere dissektion af molekylære interaktioner12. I en TXTL reaktion, kan man ændre indstillingerne biokemiske og biofysiske efter behag, som er næsten umuligt i en levende celle. I betragtning af disse fordele og de seneste forbedringer, bliver TXTL teknologien mere og mere populær som en alternativ platform for syntetisk og kvantitative biologi. Mens Fællesskabets forskning ved hjælp af TXTL er hastigt voksende og TXTL er ved at blive en standard teknologi i bioteknologi, er det vigtigt at forstå, hvordan at bruge sådanne platforme for at udvikle passende praksis relateret til udførelse af TXTL reaktioner og til den fortolkning af resultaterne.
I denne artikel vil vi beskrive hvordan en alle E. coli TXTL system til at syntetisere Bakteriofager fra deres genom11, såsom MS2 i one-pot reaktioner, (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), og T7 (dsDNA, 40 kb). Vi viser, hvordan mængden af phages syntetiseret ændringer med hensyn til nogle af indstillingerne biokemiske reaktioner (magnesium og kalium koncentrationer). Molekylær fortrængning, emuleret gennem en vifte af PIND 8000 koncentrationer, har en dramatisk effekt på phage syntese over flere størrelsesordener. Realiseringen af sådanne store biokemiske systemer i enkelt reagensglas reaktioner, at sammenfatte sideløbende processer af transskription, translation, og samlesæt, er interessant for grundlæggende spørgsmål i forbindelse med biologi og Biofysik 10 (genregulering, samlesæt), samt for udvikling af applikationer, såsom nyorientering phage funktioner til at bygge nye nanostrukturer13. Ud over en praktisk på TXTL leverer vi metoder til phage forstærkning, genom ekstraktion og oprensning og phage kvantificering af plaque assay. De metoder, der præsenteres i dette håndskrift er passende for forskere, der anvender E. coli ekstrakt baseret celle-fri systemer og er interesseret i Bakteriofager.
De protokoller, der præsenteres i dette arbejde kan opsummeres som følger: 1) Phage forstærkning (dag 1: forberede podning celler, dag 2: indre plaque, flere phage vækst, og koncentration og dag 3: rensning af phage), 2) dobbelt-strenget genom DNA-ekstraktion (fenol/chloroform udvinding), og 3) celle-fri phage reaktion og titer eksperiment (dag 1: plade værtsceller og lave agar plader, dag 2: cell-free reaktion og vært celle før kultur, og dag 3: vært celle kultur og phage titer).
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter teknik i Chen, et al. 14 for SPMC, en kritisk trin er nået ved fastsættelsen af de rette betingelser for superinfektion. Den parameter, der mest tæt styrer en vært stamme evne til at modstå superinfektion er ofte den oprindelige koncentration af det inficerer phage. Værtsceller skal være i logaritmisk vækstfase før første infektion med en meget lille mængde af phage. Til sidst, phage vil også nå logaritmisk vækst og målet er at tillade phage numre til hurtigt overgå …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette materiale er baseret på arbejde støttet af Office of Naval Research award nummer N00014-13-1-0074 (til V.N.), Human Frontier Science Program giver nummer RGP0037/2015 (til V.N.), og binationale Science Foundation giver 2014400 (til V.N.).
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
Riferimenti
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
- Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
- Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).
- Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
- Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
- Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
- Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).
- Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
- Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).
