Elektrofysiologisk opptak fra<em> Drosophila</em> Trichoid Sensilla som svar på luktstoffer med lav volatilitet
Summary
Det overordnede målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man kan presentere luktemidler med lav volatilitet for single-sensillum-opptak fra Drosophila- olfaktoriske reseptorneuroner som reagerer på langkjede kutikulære feromoner.
Abstract
Insekter er avhengige av luktesansen for å lede et bredt spekter av atferd som er kritiske for deres overlevelse, for eksempel matssøkende, rovdyr unnvikelse, oviposisjon og parring. Myriad kjemikalier med varierende volatiliteter har blitt identifisert som naturlige luktstoffer som aktiverer insekt Olfactory Receptor Neurons (ORNs). Imidlertid har det studert de olfaktoriske responsene på lavvolatilitets luktstoffer blitt hindret av manglende evne til effektivt å presentere slike stimuli ved bruk av konvensjonelle lukt-leveringsmetoder. Her beskriver vi en prosedyre som tillater effektiv presentasjon av luktstoffer med lav volatilitet for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Ved å minimere avstanden mellom luktkilden og målvevet, tillater denne metoden anvendelse av biologisk fremtredende men hittil utilgjengelige luktemidler, inkludert palmitolsyre, en stimulerende feromon med en påvist effekt på ORN som er involvert i frieri og parringsoppførsel 1 .Vår prosedyre gir dermed en ny avenue for å analysere en rekke lavvolatilitets luktstoffer for studiet av insektflukt og feromontommunikasjon.
Introduction
Drosophila ORNs reagerer på et stort antall luktstoffer, med vidtgående karbonkjedelengder og en rekke funksjonelle grupper, inkludert estere, alkoholer, ketoner, laktoner, aldehyder, terpener, organiske syrer, aminer, svovelforbindelser, heterocykliske forbindelser og aromater 2 , 3 . Luktstoffer variert i deres fysisk-kjemiske egenskaper kan ha markant forskjellige volatiliteter, indisert ved damptrykk av forbindelsen. Spesielt, biologisk relevante luktemidler for Drosophila melanogaster varierer enormt i deres volatilitet. For eksempel reagerer Ir92a ORNs på ammoniakk 4 , som er svært flyktig, med et damptrykk på 6.432 mmHg ved 20 ° C. I motsetning svarer Or67d ORNs til en mannlig feromon, cis- va-acetat ( c VA) 5 , 6 , hvis damptrykk er 43 mmHg ved 20 ° C.
Ove_content "> Det er spesielt utfordrende å studere det olfaktoriske svaret på luktstoffer med lav volatilitet med konvensjonelle lukt-leveringsmetoder, der luktemidler leveres via en luftbærer i en bærer over en relativt lang avstand ( dvs. flere centimeter). Som sådan er de rapporterte olfaktoriske svarene Til en gitt lavvolatilitet luktemiddel kan variere sterkt, avhengig av utformingen av lukt-forsyningssystemet. For eksempel varierer det rapporterte responsen av Or67d ORN til en høy dose av c VA fra ~ 40 7 -> 200 pigger / s 6 Videre er den ineffektive levering av c VA med konvensjonelle leveringsmetoder sannsynligvis tilskrevet falsk-negative resultater, hvilket fører til tolkningen at c VA i seg selv ikke er tilstrekkelig til å aktivere Or67d ORN 8. Denne tolkningen ble senere utfordret av en annen studie ved bruk av en Lukk-lukt-leveringsmetode 9. Det er derfor imperaTive å utvikle et robust lukt-levering system for effektiv presentasjon av luktstoffer med lav volatilitet.Nylig identifiserte vi flere langkjede kutikulære fettsyrer som ligander for Or47b ORNs. De er plassert i type 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Blant de langkjedede fettsyre-luktene fant vi at palmitolsyre fungerer som et afrodisiakumferomon som fremmer mannlig frieri ved å aktivere Or47b ORNs 1 . I en annen studie ved bruk av en konvensjonell lukt-leveringsmetode ble metyllaurat vist å fremkalle responser fra Or47b ORN, mens palmitolsyre fremkalte ingen respons når den ble presentert fra samme avstand 10 . Sammenlignet med c VA er langkjedede fettsyrer enda mindre flyktige, med damptrykk mindre enn 0.001 mmHg ved 25 ° C 11 . Den iboende lave volatiliteten til langkjedede fettsyre luktstoffer, som utelukker effektiv presentasjon til antennen viaKonvensjonelle lukt-leveransesystemer, antakelig sannsynlig for de falsk negative resultatene 10 . Denne inkonsekvensen fremhever mangelfullhet av konvensjonelle lukt-leveransesystemer ved å presentere luktstoffer med lav volatilitet. Det ble tidligere vist at effektiv tilførsel av kutikulære lukt krever nærhet mellom luktkilden og målvevet 6 . For å fullt ut karakterisere effektene av biologisk aktive feromoner mens de etterligner avstanden fra hvilke de sannsynligvis er truffet av fruktfluer i naturen 12 , 13 , er det enighet om at minimal avstand må prioriteres høyt i vår prosedyre.
Vår metode har ytterligere fordeler, inkludert kompatibilitet med standard elektrofysiologi rigger og teknikker. For eksisterende riggsettinger krever minimal modifikasjon for å imøtekomme denne protokollen, og de fleste SSR-trinn krever bare mindre justeringer. DetteGjør vår teknikk lett tilgjengelig for forskere med erfaring i SSR. Videre tillater vår teknikk presentasjonen av luktstoffer med lav volatilitet med skarp utbrudd og kompensasjon, korrelerende stimuluslevering med nevronrespons. Endelig muliggjør maskinvareoppsettet raske utvekslinger mellom luktpatroner, og fremskynder datainnsamling over et ønsket doseringsområde.
Vi begynner med å gjennomgå forberedelsen av referanse- og innspillingselektroder, Voksne Hemolymph-liknende (AHL) -løsning, luktende blekkpatroner og tilsvarende olfaktometer. Vi diskuterer deretter forberedelsen av palmitolsyre luktende løsninger, etterfulgt av forberedelsen av flyet til opptak. Vi fortsetter å vurdere kriteriene for å velge et trichoid sensillum for å registrere og nærmere undersøke plasseringen av luktpatronen før du presenterer representative data som er oppnådd ved hjelp av denne metoden. Til slutt konkluderer vi med å utforske nyttige anvendelser av denne teknikkenUe, noen oppstod problemer, og deres løsninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en prosedyre hvor responsene fra Or47b ORN til palmitolsyre kan induceres og registreres robust. Vi modifiserte en konvensjonell langdistance luktleveringsmetode 2 , 7 , 10 for å feilsøke problemet med utilstrekkelig feromon luktende levering. Vi løste problemet med lav luktantvolatilitet ved å levere forbindelsen via luktende patroner, hvor åpningen er plassert i millimeter av prep. Når det tas hensyn til …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ye Zhang for hjelpen med utvalgsporene og Tin Ki Tsang for hjelpen med bildene. Dette arbeidet ble støttet av en Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award og et NIH-stipend (R01DC015519) til C.-YS og NIH tilskudd (R01DC009597 og R01DK092640) til JWW
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
Riferimenti
- Lin, H. -. H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
