Denne protokol beskriver en klinisk relevant middel til at opløse hydrofobe forbindelser i et vandigt miljø ved hjælp af kombinationer af selvstændige montering peptid og aminosyre løsninger. Vores metode løser en stor begrænsning af hydrofobe therapeutics, der mangler sikker, effektiv middel til opløselighed og levering metoder til kliniske indstillinger.
Selvsamlende peptider (SAPs) er lovende køretøjer for levering af hydrofobe lægemidler til kliniske applikationer; deres amphipathic tillader dem at opløse hydrofobe forbindelser i det vandige miljø af den menneskelige krop. Men selvsamlende peptid løsninger har dårlig blod kompatibilitet (fx, lav osmolaritet), hindrer deres kliniske anvendelse gennem intravenøs administration. Vi har for nylig udviklet en generaliseret platform for hydrofobe medicinafgivelse, som kombinerer SAPs med aminosyren løsninger (SAP-AA) at styrke stof opløselighed og øge formulering osmolaritet for at nå kravene til klinisk anvendelse. Denne formulering strategi blev grundigt testet i forbindelse med tre strukturelt forskellige hydrofobe forbindelser – PP2, rottlerin og curcumin – for at vise sin alsidighed. Derudover undersøgte vi virkninger af at ændre formuleringen komponenter ved at analysere 6 forskellige SAPs, 20 naturligt eksisterende aminosyrer ved lave og høje koncentrationer, og to forskellige co opløsningsmidler dimethylsulfoxid (DMSO) og ethanol. Vores strategi viste sig for at være effektiv i at optimere komponenter for en given hydrofobe stof og terapeutiske funktion af de formulerede inhibitor, PP2, blev observeret både in vitro og i vivo. Dette manuskript skitserer vores generelle formulering metode ved hjælp af SAP-AA kombinationer for hydrofobe forbindelser, samt analyse af opløselighed som et første skridt mod potentiel anvendelse af disse formuleringer i mere funktionelle studier. Vi omfatter repraesentativ oploeselighed resultater for formulering af den hydrofobe sammensatte, curcumin, og diskutere, hvordan vores metode fungerer som en platform for fremtidige biologiske undersøgelser og sygdomsmodeller.
SAPs er en klasse af biomaterialer, der er blevet undersøgt udførligt som 3D stilladser i regenerativ medicin1,2,3,4. For nylig, er de blevet udnyttet som køretøjer til levering af lægemidler på grund af deres unikke biologiske egenskaber5,6,7,8. SAPs naturligt samles til stabil nanostrukturer9, hvilket giver et middel til narkotika indkapsling og beskyttelse. SAPs er amphipathic, består af et bestemt mønster af hydrofobe og hydrofile amino syre gentagelser, køre deres samlesæt9,10 og tillader dem at tjene som et medium mellem hydrofobe og hydrofile miljøer. Derfor, for den kliniske levering af hydrofobe narkotika – som har ekstremt lav biotilgængelighed og absorption i kroppen på grund af manglende Opløselighed i vandige miljøer11,12 – SAPs er lovende som en levering køretøj. Derudover indebærer deres sekvens mønster også at SAPs kan være rationelt designet og udviklet til at maksimere kompatibiliteten med nogen given medicin eller sammensatte (dvs.baseret på funktionelle grupper) og yderligere bistå opløselighed.
SAPs har været anvendt som effektive stof levering køretøjer i mange i in vitro og i vivo indstillinger13,14,15,16. De har også vist stor sikkerhed og biokompatibilitet. Men på grund af lav osmolaritet SAP-medicinske præparater, de kan ikke bruges til intravenøse injektioner som i kliniske indstillinger13. I betragtning af denne tilbageholdenhed, vi har for nylig udviklet en strategi, som kombinerer SAPs med aminosyren løsninger for at reducere brugen af giftige Co opløsningsmidler og øge formulering osmolaritet, og derfor kliniske relevans. Vi valgte at bruge aminosyrer, som de er byggestenene i SAPs, der allerede er klinisk accepteret, og i kombination med SAPs, de øger hydrofobe stof opløselighed mens reducerer mængden af SAP kræves17,18.
Vi har kontrolleret SAP-AA kombinationer som en generaliseret platform for hydrofobe stof opløselighed og efterfølgende levering ved at skabe en multi-trins screening pipeline og anvende det til Src-hæmmer, PP2, som en model hydrofobe sammensatte. I denne proces undersøgte vi effekten af skiftende komponenter af formuleringen-i sidste ende teste 6 forskellige SAPs, alle 20 aminosyrer på 2 forskellige koncentrationer (lav og høj, lav baseret på koncentrationer i eksisterende kliniske applikationer, og høj Koncentrationerne var 2 x, 3 x eller 5 x den kliniske koncentration baseret på den maksimale Opløselighed af hver aminosyre i vand), og 2 forskellige co opløsningsmidler – og valgte kombinationer, der solubilized PP2 for yderligere analyse. Dette stof formulering viste sig for at være effektive som fremføringsmiddel stof i cellekultur, samt i vivo modeller ved hjælp af både intratrakeal og intravenøs administration. Ligeledes vores arbejde inde på alsidigheden af SAP-AA kombinationer i solubilizing flere, strukturelt forskellige hydrofobe forbindelser i vandige miljøer; specifikt, narkotika rottlerin og curcumin18. Dette manuskript skitserer SAP-AA formulering metode og analyse af curcumin opløselighed som et eksempel på det primære skridt i vores screening pipeline. Denne protokol giver en enkel og reproducerbar måde at skærmen for de optimale kombinationer af SAP-AA, som opløses enhver given hydrofobe sammensatte.
I proceduren for formulering er der forskellige kritiske trin og punkter at overveje i fejlfinding. Først, da vi arbejder med forskellige komponenter og koncentrationer, flere vortex trin i hele protokollen sikre, at alle koncentrationer er ensartet og korrekt. Nogle af løsningerne, høj koncentration, hydrofobe aminosyre kan stadig ikke være fuldstændigt opløst efter vortexing, og i dette tilfælde, de kan blive rystet kraftigt i hånden til at hjælpe i processen. Det er ligeledes vigtigt, at SAP-AA løsninger gen…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af canadiske institutter for sundhedsforskning, tilskud opererer MOP-42546 og MOP-119514.
EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |