Solubilità dei composti idrofobici in soluzione acquosa utilizzando combinazioni di autoassemblanti peptidi e aminoacidi
Summary
Questo protocollo descrive un mezzo clinicamente applicabile di dissoluzione composti idrofobici in ambiente acquoso, utilizzando combinazioni di autoassemblanti soluzioni peptidi e aminoacidi. Il nostro metodo risolve una limitazione importante di terapeutica idrofobica, che mancano mezzi sicuri, efficienti metodi di solubilità e consegna nelle regolazioni cliniche.
Abstract
I peptidi autoassemblanti (SAPs) sono promettenti veicoli per la consegna di idrofobo terapeutica per applicazioni cliniche; loro proprietà amphipathic permettono loro di sciogliere composti idrofobici in ambiente acquoso del corpo umano. Tuttavia, autoassemblanti soluzioni del peptide hanno sangue scarsa compatibilità (ad es., bassa osmolarità), ostacolando la loro applicazione clinica attraverso le amministrazioni per via endovenosa. Recentemente abbiamo sviluppato una piattaforma generalizzata per la somministrazione di farmaci idrofobici, che combina SAPs con soluzioni dell’amminoacido (SAP-AA) per aumentare la solubilità del farmaco e aumentare osmolarità di formulazione per raggiungere i requisiti per usi clinici. Questa strategia di formulazione è stata testata nell’ambito di tre composti idrofobici strutturalmente diversi – PP2, rottlerina e curcumina – al fine di dimostrare la sua versatilità. Inoltre, abbiamo esaminato gli effetti di sostituire i componenti di formulazione analizzando 6 diversi succhi, 20 aminoacidi naturalmente esistenti alle alte e basse concentrazioni e due diverse co-solventi dimetil solfossido (DMSO) ed etanolo. La nostra strategia si è dimostrata efficace nell’ottimizzazione di componenti per un dato farmaco idrofobo e funzione terapeutica dell’inibitore formulato, PP2, è stata osservata sia in vitro che in vivo. Questo manoscritto delinea il nostro metodo di formulazione generalizzata attraverso combinazioni di SAP-AA composti idrofobici e l’analisi di solubilità come un primo passo verso l’uso potenziale di queste formulazioni negli studi più funzionale. Includiamo risultati di solubilità rappresentativi per la formulazione della curcumina composto, idrofobo e discutere di come la nostra metodologia funge da piattaforma per futuri studi biologici e modelli di malattia.
Introduction
SAPs sono una classe di biomateriali che sono stati studiati estesamente come impalcature 3D in medicina rigenerativa1,2,3,4. Più recentemente, tuttavia, essi sono stati sfruttati come veicoli per la consegna di terapeutica a causa di loro proprietà biologiche uniche5,6,7,8. SAPs naturalmente assemblare in nanostrutture stabile9, fornendo così un mezzo di incapsulamento di droga e di protezione. SAPs sono amphipathic, composto da un modello specifico di ripetizioni dell’aminoacido idrofobico e idrofilico, guida loro auto-assemblaggio9,10 e permettendo loro di servire da mezzo tra idrofobico e idrofilico ambienti. Di conseguenza, per la consegna clinica di farmaci idrofobici – che hanno estremamente bassa biodisponibilità e l’assorbimento nel corpo a causa della mancanza di solubilità in ambienti acquosi11,12 -SAPs sono promettenti come una consegna veicolo. Inoltre, i loro pattern di sequenza implica anche che SAPs può essere razionalmente progettato e realizzato per ottimizzare la compatibilità con qualsiasi dato farmaco o composti (cioè, basato su gruppi funzionali) e agevolare ulteriormente la solubilità.
SAPs sono stati applicati come veicoli di consegna di farmaco efficace in molti in vitro e in vivo le impostazioni13,14,15,16. Hanno anche mostrato biocompatibilità e grande sicurezza. Tuttavia, a causa della bassa osmolarità dei preparativi di SAP-droga, non possono essere utilizzati per iniezioni endovenose come in contesti clinici13. Considerando questo fermo, abbiamo recentemente sviluppato una strategia che combina SAPs con soluzioni di aminoacidi al fine di ridurre l’uso di co-solventi tossici e aumentare l’osmolarità di formulazione e pertanto, rilevanza clinica. Ci ha scelto di usare gli aminoacidi sono gli elementi costitutivi di SAPs, sono già clinicamente accettata, e in combinazione con SAPs, aumentano la solubilità del farmaco idrofobo mentre riducendo la quantità di SAP ha richiesto17,18.
Noi abbiamo esaminato combinazioni di SAP-AA come una piattaforma generalizzata per solubilità farmaco idrofobo e successiva consegna creando una pipeline di screening multifase e applicarlo all’inibitore Src, PP2, come un composto idrofobo di modello. In questo processo, abbiamo esaminato l’effetto di sostituire i componenti della formulazione – in ultima analisi, prove 6 diversi SAPs, tutti i 20 amminoacidi a 2 differenti concentrazioni (bassa e alta; basso basate sulle concentrazioni in applicazioni cliniche esistenti e di alta le concentrazioni erano 2x, 3x o 5x la concentrazione clinica basata sulla solubilità massima di ciascun amminoacido in acqua) e 2 diversi co-solventi – e combinazioni selezionate che solubilizzato PP2 per ulteriori analisi. Questa formulazione di droga ha dimostrato di essere efficace come un veicolo di consegna di droga in coltura delle cellule, come pure in vivo modelli utilizzando le amministrazioni intratracheale sia per via endovenosa. Allo stesso modo, il nostro lavoro ha toccato la versatilità delle combinazioni di SAP-AA in multiplo solubilizzante, strutturalmente diversi composti idrofobici in ambienti acquosi; in particolare, i farmaci rottlerina e curcumina18. Questo manoscritto delinea la formulazione ed analisi delle solubilità di curcumina come un esempio del passaggio primario nella nostra pipeline di screening SAP-AA. Questo protocollo fornisce un modo semplice e riproducibile per schermo per le combinazioni ottimale SAP-AA, che si dissolvono qualsiasi dato composto idrofobo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nella procedura di formulazione, ci sono varie fasi critiche e punti da considerare nella risoluzione dei problemi. Innanzitutto, come stiamo lavorando con i vari componenti e concentrazioni, più passaggi di vortice in tutto il protocollo assicurano che tutte le concentrazioni sono uniforme e corretta. Alcune delle soluzioni dell’amminoacido ad alta concentrazione, idrofobo, ancora non può essere completamente sciolta dopo Vortex, e in questo caso, può essere scosso vigorosamente a mano per facilitare il processo. All…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da istituti di ricerca di salute canadese, sovvenzioni di funzionamento 42546 MOP e MOP-119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
Riferimenti
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