非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出
Summary
腸管出血性発光標識細菌によるエシェリヒア属大腸菌(EHEC) の植民地化のためのマウスモデルの詳細なプロトコルが表示されます。非侵襲的生体内でイメージ投射生きている動物のシステムによってこれらの発光細菌の検出は、EHEC の植民地化の私達の現在の理解を進めることができます。
Abstract
腸管出血性大腸菌(EHEC) o157: h7、これが食中毒病原体、causesdiarrhea、出血性大腸炎 (HS) と溶血性尿毒症症候群 (HUS) は、人間の腸管に植民地化します。EHEC の植民地化、体内の詳細な機構の研究を監視して定量化 EHEC 植民地動物モデルを持つことが不可欠です。ここを監視して生きている宿主の EHEC の植民地化を定量化 EHEC に発光発現プラスミドを変換することによってマウス EHEC 植民地化モデルを紹介します。発光ラベル EHEC を接種した動物と非侵襲的体内イメージング システム検出によるマウスでの強烈な発光信号を示します。1 と 2 日間は、感染症を投稿後発光信号まだ検出感染した動物、EHEC が、少なくとも 2 日間のホストで植民地化を示唆しています。また、これらの発光 EHEC がex vivo画像から具体的に、盲腸および結腸、小腸に検索を示します。このマウス EHEC 植民地化モデルは、EHEC 植民地化メカニズムの現在のナレッジを進めるためのツールとして役立つかもしれない。
Introduction
EHEC o157: h7 は、汚染された水や食品を介しても急性腎障害4フス3HS2下痢1を引き起こす病原体です。出血性大腸菌病原性 enterobacterium で、人間1の消化管に定着します。EHEC は最初ホストの腸の粘膜上皮に付着するとき、彼らは、アタッチを誘導してその後を強制する (A ・ E) 病変を卑下分子注射器として機能するタイプ III 分泌システム (T3SS) を介して宿主細胞に植民地化の要因を注入します。接着 (植民地化) の5。A/E 病変形成に関与する遺伝子、上皮細胞卑下 (イ) 病原性島5の軌跡によってエンコードされます。
生物発光は光生成の化学反応、どちらのルシフェラーゼの可視光6を生成するその基質ルシフェリンを触媒します。この酵素プロセスよく酸素またはアデノシン三リン酸 (ATP)6の存在が必要です。生物発光イメージング (結合)、生きている動物7で、研究者の可視化およびホスト病原体の相互作用の量子化ことができます。バリは、発光細菌を次に移行し、さまざまな組織7に侵入すると、生きている動物の細菌感染症のサイクルを特徴付けることができます。これは、感染症の動的な進行を明らかにします。さらに、動物の細菌の負荷は、発光信号8; に関連します。したがって、それは単純で直接的な方法で実験動物の病理学の条件を推定するための便利なインジケーターです。
ここで使用されるプラスミドには、ルシフェラーゼ オペロン、 luxCDABE、菌Photorhabdus luminescens独自のルシフェラーゼ基板7,9をエンコードするからであるが含まれています。細菌にこのルシフェラーゼ発現プラスミドを変換することによって植民地化および伝染のプロセスは生きている動物のこれらの発光細菌を観察することによって監視できます。全体的にみて、バリとバクテリアの生物発光ラベルは、細菌数と場所、細菌性抗生物質/療法の治療と感染症/植民地6,における細菌の遺伝子発現を監視する研究者を許可します。7. 感染症の感染サイクルや遺伝子発現を調べるluxCDABEオペロンを発現する多くの病原性細菌が報告されています。尿路大腸菌10EHEC8,11,12,13, 急性胃腸炎起因を含むこれらの細菌エシェリヒア属大腸菌(EPEC)8,シトロバクター属囓14,15, サルモネラ16リステリア菌17、 Yersinia enterocolitica18,19、とコレラ20、文書化されています。
いくつかの実験的モデルは、EHEC の植民地化の in vitroとin vivo21,22,23の研究を容易にするために開発されています。しかし、EHEC の植民地化は、生体内で、研究に適した動物モデルの欠乏そしてこうして詳細の結果不足があります。EHEC 植民地化メカニズムは、生体内での研究を容易にする、動物を観察し、非侵襲的な方法で生きている動物の EHEC の植民地化を定量化するモデルを構築する貴重なです。
本稿では、生物発光表現するシステムを使用して生きている宿主に時間をかけて EHEC の植民地化を監視するマウス EHEC 植民地化モデルについて説明します。マウスは接種量発光ラベル EHEC とマウスで、非侵襲的生体内でイメージ投射システム13と発光信号が検出されました。2 日後に感染症、それらの細菌は、2 日後に感染後ホストの腸の植民地を提案した後彼らの腸に発光信号を示した発光ラベル EHEC 感染マウス。前のヴィヴォの画像データを示した盲腸と結腸マウスの具体的にこの植民地化であります。このマウス EHEC のモデルを使用して、発光 EHEC の植民地化がは、生体内イメージング システムのさらなる理解を促進する可能性が腸内細菌の植民地化の詳細なメカニズムの研究生活ホストで検出できます。EHEC による生理学的および病理学的変化。
Protocol
Representative Results
Discussion
それは、ホストまたは8,・11,・12生体内で遺伝子発現の局在を調べる EHEC ルシフェラーゼ プラスミドで形質転換が利用されていることが報告されています。ここに示すマウスモデルは、EHEC の植民地化のタイミングとローカリゼーションのマウス ホスト8検出に報告されています。それにもかかわら…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は、マウスに助けを感染と国立成功大学の研究所動物センターからの支援へのチー ・ チャン陳 Chi Mei 医療センター (台湾・台南) 医学研究科を認めます。この作品は科学の大臣によってサポートされ技術 (ほとんど) が CC に (最も 104-2321-B-006-019、105-2321-B-006-011、and106-2321-B-006-005) を付与します。
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
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