Dérivation de lignées de cellules souches provenant d’embryons préimplantatoires souris

Summary

Cet article décrit un protocole pour efficacement dérivent et la culture de lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires de souris au stade de blastocyste.

Abstract

Souris des cellules souches embryonnaires (mESC) dérivation est le processus par lequel pluripotentes lignées cellulaires sont établies d’embryons préimplantatoires. Ces lignes conservent la capacité à se renouveler ou faire la différence dans des conditions spécifiques. En raison de ces propriétés, mESC constituent un outil utile en médecine régénérative, modélisation de la maladie et études d’ingénierie tissulaire. Cet article décrit un protocole simple pour obtenir des lignes de mESC avec des rendements élevés de dérivation (60-80 %) en cultivant des blastocystes de souches de souris permissive sur cellules nourricières en milieu défini additionné du facteur inhibiteur de leucémie. Le protocole peut également être appliqué pour calculer efficacement mESC lignes de souches de souris non permissif, par le simple ajout d’un cocktail de deux inhibiteurs de petites molécules au milieu de dérivation (2i moyen). Des procédures détaillées sur la préparation et de la culture de cellules nourricières, collection et la culture des embryons de souris et la dérivation et la culture de mESC lignes sont fournies. Ce protocole ne nécessite pas de matériel spécialisé et peut être effectué dans n’importe quel laboratoire connaissant bien la culture des cellules de mammifères base.

Introduction

Cellules souches embryonnaires (CSE) sont des cellules pluripotentes provenant d’embryons préimplantatoires, qui conservent la capacité à se renouveler ou différencier sous conditions particulières¹. Basé sur ces propriétés, les ESC sont devenus un outil utile pour la médecine régénérative, modélisation de maladies et tissus ingénierie études².

ESC pour la première fois provenaient des embryons de souris préimplantatoire, originaires des lignées de souris ESC (mESC) avec faible succès^3,4. Pendant des années, l’efficacité de la dérivation est restée faible en raison de la difficulté de maintenir la pluripotence in vitro. En outre la présence d’alimentation cellules⁵, qui améliorent l’efficacité de la dérivation, promouvoir l’attachement de la colonie et d’améliorer la stabilité caryotypique⁶, plusieurs modifications du protocole plomb à une amélioration de l’entretien de la pluripotence. Les plus importants sont l’ajout de la facteur inhibiteur leucémie (LIF) mESC milieu de culture^7,8, l’utilisation d’embryons du contexte permissif de 129S2⁹ et la culture de mESC avec additionné défini sérum, libre de potentiel de facteurs de différenciation¹⁰. Plus récemment, des preuves convaincantes ont montré que l’ajout d’un cocktail de deux petites molécules modulateurs des voies de signalisation au milieu de culture mESC (appelé 2i) est préférable de maintenir la pluripotence. Le cocktail de 2i se compose d’une combinaison de l’inhibiteur MEK PD0325901, ce qui réduit les signaux de différenciation en inhibant la voie de la kinase (MAPK) protéine mitogène-, et l’inhibiteur de la GSK3β CHIR99021, ce qui améliore la survie des cellules à faible densité en activant la voie de signalisation Wnt¹¹.

Dans le présent article, nous décrivons un protocole simple pour calculer efficacement mESC lignes des blastocystes de souris. Nous suivons des procédures standards, mise en culture des embryons provenant des souches permissives sur cellules nourricières dans dérivation additionné FRV et d’un sérum remplacement¹². Suite à ce protocole, les lignes de la mescaline peut être dérivée avec des rendements équivalents à ceux obtenus dans un milieu 2i. Malgré cela, 2i peut être ajoutée pour éviter d’éventuels problèmes avec pluripotence maintenance ou lorsque vous travaillez avec des souches non permissif.

Protocol

l’utilisation des animaux décrits dans les sections ci-dessous a été approuvée par le Comité d’éthique sur l’Animal et de la recherche humaine de l’Universitat Autònoma de Barcelona et par la d Departament ' Pesca de Agricultura, Ramaderia, j’ai Alimentació de la Generalitat de Catalunya (protocole #8741). 1. Inactivation cellule chargeur et stockage Remarque : fibroblastes humains prépuce (HFF-1) ont été précédemment gelés dans 1 mL de…

Representative Results

Suite à ce protocole, plus de 95 % de la formation de l’excroissance devrait être réalisé après la première semaine de la culture (Figure 1 a). Mise en place de lignes de mESC après six passages est variable entre les répliques expérimentales, avec un succès moyen de 60 à 80 %. L’ajout de 2i n’améliore pas significativement les résultats lorsque vous travaillez avec des souches de souris permissive, tels que ceux ayant une formation de 129S…

Discussion

Bien que la dérivation de ligne mESC est une procédure connue couramment utilisée dans de nombreux laboratoires, son efficacité n’est pas toujours plus élevée que prévu en raison des multiples facteurs qui peuvent perturber la pluripotence entretien. Dans le présent article, nous montrons, étape par étape, comment faire pour établir des lignes de mESC avec des rendements élevés à l’aide d’un protocole simple et fiable. Ces gains d’efficacité sont similaires à ceux rapportés dans la littérature.<…

Materials

1 mL sryringe	BD	309628
2-β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350-010
4-well plate	Thermo Scientific Nunc	176740
Acidic Tyrode's solution	Home-made		See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488	Molecular Probes – Invitrogen	A-21200	1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle	BD	304000	Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin	Fluka	48724	Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Molecular Probes – Invitrogen	A-11037	1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.
HBSS	BioWest	L0611
Hepes-buffered CZB	Home-made		See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Human foreskin fibroblasts	ATCC	ATCCSCRC-1041	For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor	Merk Millipore	ESG1106
Mice	Charles River/Harlan		It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.
Mineral oil	Sigma	M8410	Embryo tested. Photosensitive.
Mitomycin C	Serva	2980501	Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA	Sigma	A5228	1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP	R&D Systems	MAB1368	1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Petri dish (60mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Pregnant mare's serum gonadotropin	Foligon	Foligon-1000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Rabbit policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 dilution
T75 falcon	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution