Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Abstract

Mouse sulle cellule staminali embrionali (mESC) derivazione è il processo da cui pluripotenti vengono stabilite linee cellulari da embrioni preimpianto. Queste linee mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare in condizioni specifiche. Grazie a queste proprietà, mESC sono uno strumento utile in medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e gli studi di ingegneria tissutale. Questo articolo viene descritto un semplice protocollo per ottenere linee mESC con efficienze di derivazione alta (60-80%) coltivando blastocisti da diversi ceppi di topi permissiva su cellule di alimentatore in medium definito completati con fattore inibitorio di leucemia. Il protocollo può anche applicarsi per derivare in modo efficiente mESC linee da diversi ceppi di topi non permissivi, per semplice aggiunta di un cocktail di due piccole molecole inibitori al medium di derivazione (2i medio). Procedure dettagliate sulla preparazione e sulla coltura di cellule di alimentatore, raccolta e cultura d’embrioni di topo e derivazione e mESC linee sono fornite. Questo protocollo non richiede attrezzature specializzate e può essere effettuato in qualsiasi laboratorio con competenze di cultura di base su cellule di mammifero.

Introduction

Cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule pluripotenti derivate da embrioni preimpianto, che mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare sotto condizioni specifiche¹. Basato su queste proprietà, ESC sono diventati uno strumento utile per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e di studi ingegneria del tessuto².

ESC sono stati derivati per la prima volta da embrioni di topo preimpianto, originari del mouse ESC (mESC) linee con successo basso^3,4. Per anni, l’efficienza di derivazione è rimasta bassa a causa della difficoltà di mantenere la pluripotenza in vitro. Inoltre la presenza di alimentatore cellule⁵, che migliorano l’efficienza di derivazione, promuovere allegato di Colonia e migliorare stabilità karyotypic⁶, diverse modifiche del protocollo piombo ad un miglioramento nella manutenzione di pluripotenza. Le più importanti furono l’aggiunta di fattore inibitorio di leucemia (LIF) a mESC coltura^7,8, l’uso di embrioni dal 129S2 sfondo permissiva⁹ e la cultura della mescita con supplementato con definita siero, privo di potenziali fattori di differenziazione¹⁰. Più recentemente, una prova convincente ha dimostrato che l’aggiunta di un cocktail di due piccole molecole modulatori delle vie di segnalazione al terreno di coltura mESC (noto come 2i) non consiglia di mantenere la pluripotenza. La 2i cocktail è costituito da una combinazione dell’inibitore MEK PD0325901, che riduce i segnali di differenziazione inibendo la chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK), e l’inibitore di GSK3β CHIR99021, che migliora la sopravvivenza delle cellule a bassa densità attivando la via di Wnt¹¹.

Nel presente articolo, descriviamo un semplice protocollo per derivare in modo efficiente mESC linee da blastocisti di topo. Seguiamo le procedure standard, la coltura di embrioni da ceppi permissive su cellule di alimentatore in medium di derivazione completate con LIF e un siero sostituzione¹². Seguendo questo protocollo, mESC linee può essere derivato con efficienze equivalenti a quelli ottenuti in mezzo 2i. Nonostante ciò, 2i possono essere aggiunti per evitare possibili problemi con pluripotenza manutenzione o quando si lavora con ceppi non permissivi.

Protocol

l’uso degli animali descritti nelle sezioni riportate di seguito è stato approvato dal comitato di etica animale e umana ricerca della Universitat Autònoma de Barcelona e dalla Departament d’ ' Agricultura, Ramaderia, Pesca ho Alimentació della Generalitat de Catalunya (protocollo #8741). 1. inattivazione delle cellule feeder e deposito Nota: fibroblasti umani del prepuzio (HFF-1) precedentemente sono stati congelati in 1 mL di soluzione di congelamento comp…

Representative Results

A seguito di questo protocollo, oltre il 95% della formazione di conseguenza dovrebbe avvenire dopo la prima settimana della cultura (Figura 1A). Creazione di linee di mESC dopo sei passaggi è variabile tra repliche sperimentali, con una media di successo del 60-80%. L’aggiunta di 2i non migliora significativamente i risultati quando si lavora con diversi ceppi di topi permissiva, come quelli con un background di 129S2, ma è necessario quando si lavora con …

Discussion

Anche se mESC linea derivazione è una procedura ben nota ordinariamente utilizzata in molti laboratori, sua efficienza non è sempre più in alto come previsto a causa di molteplici fattori che possono disturbare la pluripotenza manutenzione. Nel presente articolo abbiamo illustrato, passo dopo passo, come stabilire linee mESC con alta efficienza utilizzando un protocollo semplice e affidabile. Queste efficienze sono simili a quelli segnalati nella letteratura.

Per garantire la massima effici…

Materials

1 mL sryringe	BD	309628
2-β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350-010
4-well plate	Thermo Scientific Nunc	176740
Acidic Tyrode's solution	Home-made		See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488	Molecular Probes – Invitrogen	A-21200	1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle	BD	304000	Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin	Fluka	48724	Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Molecular Probes – Invitrogen	A-11037	1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.
HBSS	BioWest	L0611
Hepes-buffered CZB	Home-made		See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Human foreskin fibroblasts	ATCC	ATCCSCRC-1041	For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor	Merk Millipore	ESG1106
Mice	Charles River/Harlan		It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.
Mineral oil	Sigma	M8410	Embryo tested. Photosensitive.
Mitomycin C	Serva	2980501	Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA	Sigma	A5228	1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP	R&D Systems	MAB1368	1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Petri dish (60mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Pregnant mare's serum gonadotropin	Foligon	Foligon-1000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Rabbit policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 dilution
T75 falcon	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution