Denne artikkelen beskriver en protokoll for å effektivt utlede og kultur pluripotent stilk cellelinjer fra mouse embryoer på blastocysten scenen.
Mus embryonale stamcelleforskningen (mESC) avledning er prosessen som pluripotent cellelinjer er etablert fra preimplantation embryo. Disse linjene beholde evnen til selv-fornye eller skille ved bestemte betingelser. På grunn av disse egenskapene, mESC er et nyttig verktøy i regenerativ medisin, sykdom modellering og vev tekniske studier. Denne artikkelen beskriver en enkel protokoll for å få mESC linjer med høy avledning effektivitet (60-80%) av dyrking blastocysts fra ettergivende musen stammer på materen celler i definerte medium med leukemi hemmende faktor. Protokollen kan også brukes til å effektivt avledet mESC linjer fra uten tillatelse musen stammer, med enkle tillegg av en cocktail av to små molekyl hemmere til avledning medium (2i medium). Detaljerte prosedyrer på forberedelse og kultur av materen celler, innsamling og kultur av mouse embryoer, og avledning og kultur mESC linjer er gitt. Denne protokollen krever ikke spesialisert utstyr og kan utføres i et laboratorium med grunnleggende pattedyr celle kultur kompetanse.
Embryonale stamceller (ESC) er pluripotent celler avledet fra preimplantation embryo, som beholde evnen til selv-fornye eller skille under bestemte forhold1. Basert på disse egenskapene, ESC har blitt et nyttig verktøy for regenerativ medisin, sykdom modellering og vev tekniske studier2.
ESC var avledet for første gang fra preimplantation mouse embryoer, stammer mus ESC (mESC) linjer med lav suksess3,4. I år forble avledning effektiviteten lave på grunn av vanskelighetene ved å opprettholde pluripotency i vitro. Dessuten tilstedeværelsen av materen celler5, som bedre avledning effektivitet, fremme kolonien vedlegg, og forbedre karyotypic stabilitet6, flere modifikasjoner av protokollen føre til en forbedring i pluripotency vedlikehold. Det viktigste var tillegg av leukemi hemmende faktor (LIF) mESC kultur medium7,8, bruk av embryoer fra 129S2 ettergivende bakgrunn9 og kultur mESC med medium med definert serum, gratis potensielle differensiering faktorer10. Flere nylig, overbevisende bevis har vist at tillegg av en cocktail av to små molekyl modulatorer av signalveier til mESC kultur medium (kjent som 2i) er best å opprettholde pluripotency. 2i cocktail består av en kombinasjon av den MEK inhibitor PD0325901, noe som reduserer differensiering signaler ved å hemme mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) veien, og den GSK3β inhibitor CHIR99021, som forbedrer celle overlevelse på lav tetthet ved å aktivere Wnt veien11.
I denne artikkel beskriver vi en enkel protokoll for effektivt utlede mESC linjer fra mus blastocysts. Vi følger standard prosedyrer, dyrking embryoer fra ettergivende stammer på materen celler i avledning medium supplert med LIF og en serum erstatning12. Etter denne protokollen, mESC linjer kan avledes med effektivitet tilsvarende de innhentet i 2i medium. Til tross for dette, kan 2i legges for å unngå mulige problemer med pluripotency vedlikehold eller når du arbeider med uten tillatelse stammer.
Selv om mESC linje avledning er en velkjent prosedyre rutinemessig brukes i mange laboratorier, er effektiviteten ikke alltid så høyt som forventet på grunn av flere faktorer som kan forstyrre pluripotency vedlikehold. I denne artikkel vise vi, trinn for trinn, hvordan å etablere mESC linjer med høy effektivitet bruker en enkel og pålitelig protokoll. Disse effektivitet er lik de som er rapportert i litteraturen.
For å sikre maksimal effektivitet, er det viktig å kontrollere cellene da…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jonatan Lucas for hans teknisk assistanse med mater cellekultur, Servei Estabulari de la UAB for dyr omsorg og Domènec Martín for innspilling av video. Dette arbeidet har vært støttet av Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R og Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC er begunstiget av en PIF-UAB fellesskap.
1 mL sryringe | BD | 309628 | |
2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
BSA | Sigma | A3311 | |
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
DMSO | Sigma | 41640 | |
DMEM | BioWest | L0107 | |
FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
HBSS | BioWest | L0611 | |
Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |