Avledning av stamcelleforskningen linjer fra mus Preimplantation embryo

Summary

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å effektivt utlede og kultur pluripotent stilk cellelinjer fra mouse embryoer på blastocysten scenen.

Abstract

Mus embryonale stamcelleforskningen (mESC) avledning er prosessen som pluripotent cellelinjer er etablert fra preimplantation embryo. Disse linjene beholde evnen til selv-fornye eller skille ved bestemte betingelser. På grunn av disse egenskapene, mESC er et nyttig verktøy i regenerativ medisin, sykdom modellering og vev tekniske studier. Denne artikkelen beskriver en enkel protokoll for å få mESC linjer med høy avledning effektivitet (60-80%) av dyrking blastocysts fra ettergivende musen stammer på materen celler i definerte medium med leukemi hemmende faktor. Protokollen kan også brukes til å effektivt avledet mESC linjer fra uten tillatelse musen stammer, med enkle tillegg av en cocktail av to små molekyl hemmere til avledning medium (2i medium). Detaljerte prosedyrer på forberedelse og kultur av materen celler, innsamling og kultur av mouse embryoer, og avledning og kultur mESC linjer er gitt. Denne protokollen krever ikke spesialisert utstyr og kan utføres i et laboratorium med grunnleggende pattedyr celle kultur kompetanse.

Introduction

Embryonale stamceller (ESC) er pluripotent celler avledet fra preimplantation embryo, som beholde evnen til selv-fornye eller skille under bestemte forhold¹. Basert på disse egenskapene, ESC har blitt et nyttig verktøy for regenerativ medisin, sykdom modellering og vev tekniske studier².

ESC var avledet for første gang fra preimplantation mouse embryoer, stammer mus ESC (mESC) linjer med lav suksess^3,4. I år forble avledning effektiviteten lave på grunn av vanskelighetene ved å opprettholde pluripotency i vitro. Dessuten tilstedeværelsen av materen celler⁵, som bedre avledning effektivitet, fremme kolonien vedlegg, og forbedre karyotypic stabilitet⁶, flere modifikasjoner av protokollen føre til en forbedring i pluripotency vedlikehold. Det viktigste var tillegg av leukemi hemmende faktor (LIF) mESC kultur medium^7,8, bruk av embryoer fra 129S2 ettergivende bakgrunn⁹ og kultur mESC med medium med definert serum, gratis potensielle differensiering faktorer¹⁰. Flere nylig, overbevisende bevis har vist at tillegg av en cocktail av to små molekyl modulatorer av signalveier til mESC kultur medium (kjent som 2i) er best å opprettholde pluripotency. 2i cocktail består av en kombinasjon av den MEK inhibitor PD0325901, noe som reduserer differensiering signaler ved å hemme mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) veien, og den GSK3β inhibitor CHIR99021, som forbedrer celle overlevelse på lav tetthet ved å aktivere Wnt veien¹¹.

I denne artikkel beskriver vi en enkel protokoll for effektivt utlede mESC linjer fra mus blastocysts. Vi følger standard prosedyrer, dyrking embryoer fra ettergivende stammer på materen celler i avledning medium supplert med LIF og en serum erstatning¹². Etter denne protokollen, mESC linjer kan avledes med effektivitet tilsvarende de innhentet i 2i medium. Til tross for dette, kan 2i legges for å unngå mulige problemer med pluripotency vedlikehold eller når du arbeider med uten tillatelse stammer.

Protocol

Bruk av dyrene beskrevet i delene nedenfor er godkjent av den etiske komiteen på dyr og menneske forskning av Universitat Autònoma de Barcelona og Departament d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca jeg Alimentació av Generalitat de Catalunya (protocol #8741). 1. mater celle inaktivering og lagring Merk: Human foreskin fibroblaster (HFF-1) var tidligere frosset i 1 mL av frysing løsning med 90% fosterets Bovine Serum (FBS) og 10% dimethyl sulfoxide ( DMSO) og lag…

Representative Results

Etter denne protokollen, over 95% av utvekst formasjon skal oppnås etter den første uken av kultur (figur 1A). Etablering av mESC linjer etter seks passasjer er variabel blant eksperimentelle gjentak, med en gjennomsnittlig suksess på 60-80%. Tillegg av 2i vesentlig forbedrer ikke resultatet når du arbeider med ettergivende musen stammer, som dem med 129S2 bakgrunn, men det er nødvendig når du arbeider med uten tillatelse stammer. <p class="jove_con…

Discussion

Selv om mESC linje avledning er en velkjent prosedyre rutinemessig brukes i mange laboratorier, er effektiviteten ikke alltid så høyt som forventet på grunn av flere faktorer som kan forstyrre pluripotency vedlikehold. I denne artikkel vise vi, trinn for trinn, hvordan å etablere mESC linjer med høy effektivitet bruker en enkel og pålitelig protokoll. Disse effektivitet er lik de som er rapportert i litteraturen.

For å sikre maksimal effektivitet, er det viktig å kontrollere cellene da…

Materials

1 mL sryringe	BD	309628
2-β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350-010
4-well plate	Thermo Scientific Nunc	176740
Acidic Tyrode's solution	Home-made		See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488	Molecular Probes – Invitrogen	A-21200	1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle	BD	304000	Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin	Fluka	48724	Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Molecular Probes – Invitrogen	A-11037	1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.
HBSS	BioWest	L0611
Hepes-buffered CZB	Home-made		See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Human foreskin fibroblasts	ATCC	ATCCSCRC-1041	For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor	Merk Millipore	ESG1106
Mice	Charles River/Harlan		It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.
Mineral oil	Sigma	M8410	Embryo tested. Photosensitive.
Mitomycin C	Serva	2980501	Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA	Sigma	A5228	1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP	R&D Systems	MAB1368	1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Petri dish (60mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Pregnant mare's serum gonadotropin	Foligon	Foligon-1000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Rabbit policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 dilution
T75 falcon	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution