Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Summary

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Abstract

Derivação de células-tronco embrionárias (mESC) do mouse é o processo pelo qual pluripotentes linhagens celulares estabelecidas dos embriões pré-implantação. Estas linhas mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas. Devido a essas propriedades, o mESC são uma ferramenta útil na medicina regenerativa, modelagem de doença e estudos de engenharia de tecidos. Este artigo descreve um protocolo simples para obter linhas de mESC com eficiências de alta derivação (60-80%) pelo cultivo de blastocistos de estirpes de rato permissiva em células alimentador definido suplementado com fator inibitório de leucemia. O protocolo também pode ser aplicado derive eficientemente mESC linhas de cepas não-permissiva do mouse, pela simples adição de um coquetel de dois inibidores da pequeno-molécula ao meio de derivação (2i médio). Os procedimentos detalhados sobre a preparação e a cultura de células de alimentador, coleta e cultura de embriões de rato e derivação e cultura das linhas mESC são fornecidos. Este protocolo não requer equipamento especializado e pode ser realizado em qualquer laboratório com conhecimentos de cultura de pilha mamífera básica.

Introduction

Células-tronco embrionárias (ESC) são pluripotentes células derivadas de embriões pré-implantação, que mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas¹. Baseado sobre essas propriedades, ESC tornaram-se uma ferramenta útil para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de estudos engenharia de tecido².

ESC foram derivados pela primeira vez embriões pré-implantação do mouse, originando linhas ESC (mESC) rato com sucesso baixa^3,4. Durante anos, a eficiência de derivação permaneceu baixa devido à dificuldade de manutenção da pluripotência em vitro. Além disso, a presença de alimentador células⁵, que melhoram a eficiência de derivação, promover a fixação da colônia e realçar estabilidade espectofotômetro⁶, várias modificações das protocolo conduzir a uma melhoria na manutenção da pluripotência. As mais importantes foram a adição de fator inibitório de leucemia (LIF) mESC meio de cultura^7,8, a utilização de embriões da 129S2 fundo permissiva⁹ e a cultura dos mESC com suplementado com definido soro, livre de potenciais fatores de diferenciação¹⁰. Mais recentemente, evidências convincentes tem mostrado que a adição de um coquetel de dois moduladores da pequeno-molécula de vias de sinalização para o meio de cultura de mESC (conhecido como 2i) é melhor manter a pluripotência. O cocktail de 2i consiste numa combinação de inibidor MEK PD0325901, que reduz os sinais de diferenciação por inibição da via de quinase (MAPK) proteína mitogen-ativado, e o inibidor de GSK3β CHIR99021, que aumenta a sobrevivência da pilha de baixa densidade Ativando o Wnt caminho¹¹.

No presente artigo, descrevemos um protocolo simples derive eficientemente mESC linhas de blastocistos de rato. Seguimos os procedimentos padrão, cultivo de embriões de estirpes permissivas em células alimentador suplementado de derivação com LIF e uma substituição de soro¹². Seguir este protocolo, mESC linhas pode ser derivada com eficiências equivalentes às obtidas no meio de 2i. Apesar disso, 2i pode ser adicionado para evitar possíveis problemas com manutenção de pluripotência, ou quando se trabalha com cepas não-permissiva.

Protocol

o uso dos animais descritos nas seções abaixo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da Universitat Autònoma de Barcelona e Animal e pelo departamento d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca eu Alimentació da Generalitat de Catalunya (protocolo #8741). 1. armazenamento e inativação de célula alimentador Nota: fibroblastos humanos prepúcio (HFF-1) foram previamente congelados em 1 mL de solução de congelação composta de 90% soro Fetal bovin…

Representative Results

Na sequência deste protocolo, mais 95% da formação de consequência deve ser alcançado após a primeira semana da cultura (figura 1A). Estabelecimento de linhas de mESC após seis passagens é variável entre repetições experimentais, com uma média de 60-80% de sucesso. A adição de 2i não melhorar significativamente os resultados ao trabalhar com cepas de rato permissivas, tais como aqueles com antecedentes de 129S2, mas é necessário quando se tra…

Discussion

Embora a derivação de linha mESC é um procedimento bem conhecido rotineiramente utilizado em muitos laboratórios, sua eficiência não é sempre tão alta quanto o esperado devido os múltiplos fatores que podem perturbar a manutenção da pluripotência. No presente artigo mostramos, passo a passo, como estabelecer linhas de mESC com alta eficiência usando um protocolo simples e confiável. Estas eficiências são semelhantes aos relatados na literatura.

Para garantir a máxima eficiênc…

Materials

1 mL sryringe	BD	309628
2-β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350-010
4-well plate	Thermo Scientific Nunc	176740
Acidic Tyrode's solution	Home-made		See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488	Molecular Probes – Invitrogen	A-21200	1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle	BD	304000	Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin	Fluka	48724	Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Molecular Probes – Invitrogen	A-11037	1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.
HBSS	BioWest	L0611
Hepes-buffered CZB	Home-made		See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Human foreskin fibroblasts	ATCC	ATCCSCRC-1041	For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor	Merk Millipore	ESG1106
Mice	Charles River/Harlan		It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.
Mineral oil	Sigma	M8410	Embryo tested. Photosensitive.
Mitomycin C	Serva	2980501	Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA	Sigma	A5228	1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP	R&D Systems	MAB1368	1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Petri dish (60mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Pregnant mare's serum gonadotropin	Foligon	Foligon-1000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Rabbit policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 dilution
T75 falcon	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution