Дифференцирование линий стволовых клеток мыши Предимплантационная эмбрионов
Summary
Эта статья описывает протокол эффективно получать и культуры линии плюрипотентных стволовых клеток эмбрионов мыши на стадии бластоцисты.
Abstract
Дифференцирование мыши эмбриональных стволовых клеток (mESC) это процесс, посредством которого плюрипотентных клеточных линий созданы с предимплантационной эмбрионов. Эти линии сохраняют способность самостоятельно обновить или дифференцировать при определенных условиях. Благодаря этим свойствам mESC являются полезным инструментом в регенеративной медицины, болезни моделирования и инженерные исследования тканей. Эта статья описывает простой протокол для получения mESC линии с высоким дифференцирование эффективности (60-80%), культивирование бластоцисты от штаммов разрешительной мыши на фидер клетки в определенной среде, дополнена лейкемия ингибирующего фактора. Протокол также может применяться эффективно получить mESC линии от не разрешительной мыши штаммов, путем простого добавления коктейль из двух малых молекул ингибиторов дифференцирование средний (2i средний). Предоставляются подробные процедуры по подготовке и культуры клеток фидер, сбор и культуры зародышей мыши, и дифференцирование и культуры mESC линий. Этот протокол не требует специализированного оборудования и может осуществляться в любой лаборатории с опытом культуры основных клеток млекопитающих.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки (ESC) являются плюрипотентных клеток, полученных от Предимплантационная эмбрионов, которые сохраняют способность самостоятельно обновить или дифференцировать под конкретные условия1. На основе этих свойств, ESC стали полезным инструментом для регенеративной медицины, болезни моделирования и ткани, инженерных исследований2.
ESC в первый раз были получены эмбрионы Предимплантационная мыши, возникая мыши ESC (mESC) линии с низкой успех3,4. Лет дифференцирование эффективность оставалась низкой из-за сложности поддержания плюрипотентности в пробирке. Кроме того присутствие фидер клетки5, который улучшить эффективность дифференцирование, поощрение вложения колонии и повышения стабильности karyotypic6, несколько модификаций протокола приведет к улучшению обслуживания плюрипотентности. Наиболее важными являются добавлением лейкемия ингибирующего фактора (LIF) для mESC культуры среднего7,8, использование эмбрионов с разрешительной фон 129S29 и культуры mESC с средой, дополнена определены сыворотка, свободной от потенциальных факторов дифференциации10. Совсем недавно убедительных доказательств показал, что добавление коктейль из двух мелкомолекулярных модуляторы сигнальных путей на носитель культуры mESC (известный как 2i) является лучшим для поддержания плюрипотентности. 2i коктейль состоит из комбинации MEK ингибитором PD0325901, который уменьшает дифференциация сигналов путем ингибирования Митоген активированный протеин киназы (MAPK) путь, и GSK3β ингибитором CHIR99021, который повышает выживаемость клеток в низкой плотности Активировав путь Wnt11.
В настоящей статье мы опишем простой протокол эффективно получить mESC линии от мыши бластоцисты. Мы следуем стандартной процедуры, культивирование эмбрионов от разрешительной штаммов на фидер клетки в среде дифференцирование, дополненная LIF и замена сыворотке12. После этого протокола, mESC линии могут быть получены с КПД, эквивалентные тем, которые получили в среде 2i. Несмотря на это чтобы избежать возможных проблем с поддержания плюрипотентности или при работе с не разрешительной штаммы могут добавляться 2i.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя mESC линии наследования является известным процедура обычно используется во многих лабораториях, его эффективность не всегда как высокими, как ожидалось, из-за многочисленных факторов, которые могут нарушить плюрипотентности обслуживания. В настоящей статье мы покажем, шаг за шаго…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Jonatan Лукас за его техническую помощь с подачи клеточной культуры, UAB-де-ла Estabulari обслуживание для ухода за животными и Мартин Domènec для записи видео. Эта работа была поддержана Ministerio де Economia y развитию AGL2014-52408-R и де Женералитата Каталонии 2014 SGR-524. MVC является бенефициаром PIF-ЗАО стипендий.
Materials
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
Riferimenti
- Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
