Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme
Summary
Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.
Abstract
Fare embriyonik kök hücre (mESC) türetme tarafından hangi pluripotent Preimplantasyon embriyoların hücre hatları kurulur işlemidir. Bu satırları yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar altında ayırt etmek için korur. Bu özellikleri nedeniyle, mESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları yararlı bir araç vardır. Bu makalede mESC hatları yüksek türetme verimliliği (% 60-80) ile elde etmek için basit bir protokol blastokistlerin keyfi fare suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan tanımlanmış orta lösemi inhibitör faktörü ile takıma gelen Kültür tarafından açıklanır. Protokol Ayrıca verimli bir şekilde mESC satırları keyfi fare suşları türetmek için iki küçük molekül inhibitörleri türetme orta (2i orta) bir kokteyl basit eklenmesiyle uygulanabilir. Hazırlık ve besleyici hücreler, toplama ve fare embriyolar ve türetme kültür ve kültür mESC satırlarının kültür üzerinde ayrıntılı yordamlar sağlanmaktadır. Bu iletişim kuralı özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir laboratuvar temel memeli hücre kültür uzmanlığı ile yapılabilir.
Introduction
Embriyonik kök hücreleri (ESC) yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar1altında ayırt etmek için korumak Preimplantasyon embriyo elde pluripotent hücreler vardır. Bu özelliklere dayalı, ESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları2için yararlı bir araç olmuştur.
ESC den türemiş olan ilk kez fare ESC (mESC) hatları düşük başarı3,4ile kaynaklanan Preimplantasyon fare embriyo. Yıllardır, türetme verimliliği pluripotency içinde vitromuhafaza zorluğu nedeniyle düşük kaldı. Ayrıca türetme verimliliği artırmak, besleyici hücreler5‘ varlığı koloni eki tanıtmak ve karyotip istikrar6, birçok değişikliği bir iyileşme pluripotency bakım iletişim kuralı müşteri adayının geliştirmek. MESC kültür orta7,8, embriyo 129S2 keyfi arka plan9 kullanımı için en önemli yanı sıra, lösemi inhibitör faktörü (LIF) vardı ve mESC ile takıma orta ile Kültür tanımlanan serum, potansiyel farklılaşma ücretsiz10faktörler. Daha yakın zamanlarda, kanıt zorlayıcı bir kokteyl mESC kültür (2i da bilinir) orta sinyal yollar iki küçük molekül modülatörler ilavesi pluripotency korumak en iyi olduğunu göstermiştir. MEK inhibitörü farklılaşma sinyalleri mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) yolu engelleyerek azaltır, PD0325901 ve GSK3β inhibitörü hücre sağkalım, düşük yoğunluklu geliştirir CHIR99021 2i kokteyl oluşur Wnt yolu11etkinleştirerek.
Bugünkü yazıda, verimli bir şekilde mESC satırları fare blastokistlerin türetmek için basit bir protokol açıklar. Standart prosedürler, keyfi suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan türetme orta LIF ve serum yerine12ile gelen embriyo kültürü takip ediyoruz. Bu iletişim kuralı, mESC çizgileri takip verimliliği 2i ortamda elde edilen eşdeğer ile elde edilebilir. Buna rağmen 2i sigara keyfi suşları ile çalışırken pluripotency bakım veya olası sorunlardan kaçınmak için eklenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
MESC satır türetme rutin olarak birçok laboratuvarlarda kullanılan iyi bilinen bir işlem olmakla birlikte, verimlilik her zaman pluripotency bakım rahatsız edemez Multipl faktörler nedeniyle beklendiği gibi yüksek değil. Mevcut makalede biz, adım adım, basit ve güvenilir bir iletişim kuralı kullanılarak yüksek verimliliği ile mESC satırları oluşturmak nasıl gösterir. Bu verimliliği literatürde bildirilen benzer.
Maksimum verimliliği sağlamak için hücreleri her gü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Jonatan Lucas besleyici hücre kültürü, Servei Estabulari de la UAB hayvan bakımı için ve Domènec video kayıt için Martín ile onun teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser “gayri resmi” de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R ve Generalitat de tarafından desteklenen Catalunya 2014 SGR-524. MVC PIF-UAB bursu yararlanıcı olduğunu.
Materials
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
Riferimenti
- Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
