Piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

Summary

Chirurgia piezoelettrica ha portato a miglioramenti in chirurgia maxillo-facciale e dentale umano. Abbiamo sviluppato un protocollo per ottimizzare la chirurgia piezoelettrica per chirurgia cranica finestra nei topi.

Abstract

La microscopia multifotonica è stato ampiamente adattata per l’imaging di neuroni in vivo. Formazione immagine ripetuta richiede l’impianto di una finestra cranica o ripetute assottigliamento del cranio. Chirurgia cranica finestra viene in genere eseguita con un trapano rotante ad alta velocità, e molti ricercatori trovano stimolante per impedire che il trapano danneggiare il delicato dura e vasi sanguigni. Vasto e la pratica è necessaria per rimuovere l’osso senza danneggiare i tessuti sottostanti e quindi chirurgia cranica finestra può essere difficile, che richiede tempo e produrre danni ai tessuti. La chirurgia piezoelettrica, che viene ampiamente utilizzata per la chirurgia maxillo-facciale e dentale, utilizza le vibrazioni ad ultrasuoni per rimuovere l’osso senza danneggiare i tessuti molli. Abbiamo sviluppato un metodo applicando la chirurgia piezoelettrica per migliorare la chirurgia cranica finestra nei topi in preparazione per l’imaging multiphoton. Confronti all’interno del nostro laboratorio di trovano che il metodo richiede meno tempo di chirurgia e ha un tasso medio più basso delle complicazioni dovuto spurgo dural rispetto alla chirurgia cranica finestra con un trapano rotativo.

Introduction

Chirurgia cranica finestra per prepararsi roditori multifotonica imaging in vivo è diventata un’importante tecnica nell’ambito delle neuroscienze. La rimozione o l’assottigliamento dell’osso è necessario preparare il mouse per imaging ottico con un microscopio multifotonica. Questa chirurgia è eseguita rimuovendo completamente un’area dell’osso per esporre la sottostante dura¹o fluidificando una regione dell’osso senza rimozione completa dalla dura². L’approccio di cranio sottile può produrre meno infiammazione e attivazione della microglia³ ma fornisce una profondità minore di imaging, una dimensione di finestra di imaging più piccola (200 µm) e un periodo di tempo limitato durante il quale la finestra può essere imaged a causa di ricrescita ossea² . L’aggiunta di una finestra di vetro lucido e rinforzato (porte) può aumentare le dimensioni imaging e il periodo di formazione immagine, ma è difficile da eseguire⁴.

Entrambi gli interventi attuali utilizzano un trapano rotativo ad alta velocità per sottile o rimuovere l’osso dal cranio. La tecnica di cranio sottile utilizza anche un bisturi dopo il trapano per fluidificare ulteriormente l’osso². La tecnica di porte richiede il passaggio aggiuntivo di alta velocità di lucidatura con grana⁴. In un’alta velocità trapano rotativo, un’aria alimentata turbina o motore elettrico fa sì che la punta del trapano a girare ad alta velocità. Come Trapani rotativi sezione sia dell’osso che dei tessuti molli, esiste un rischio di danneggiare la dura madre e dei vasi sanguigni di fondo. Il successo della chirurgia dipende dalla abilità del chirurgo. Oltre a queste finestre preparate con metodi chirurgici meccanici, un metodo chimico di otticamente il cranio con diverse soluzioni di compensazione è stato sviluppato^5,6. Tuttavia, poiché la chirurgia piezoelettrica è un metodo meccanico di chirurgia, nostri confronti qui sarà limitati ad altri metodi meccanici.

Dispositivi chirurgici piezoelettrici utilizzano vibrazioni ultrasoniche per abbattere osso mineralizzato senza danneggiare tessuti molli sottostanti e quindi offrono un approccio per sottile rapidamente una vasta area dell’osso. In un manipolo chirurgico piezoelettrico, la turbina è sostituita da una pila di dischi ceramici e quando viene applicata la corrente, i dischi vibrano a frequenze ultrasoniche. Le vibrazioni vengono trasferite attraverso il manipolo a diamante rivestiti suggerimenti per tagliare attraverso l’osso senza danneggiare tessuti molli, un vantaggio su Trapani rotativi che non discriminano tra i tipi di tessuto. La chirurgia piezoelettrica è stato originariamente sviluppata per l’uso nell’uomo di Tomaso Vercellotti e ha portato a miglioramenti nel dentale e cranio-maxilofacial chirurgia^7,8,9,10,11 .

La chirurgia piezoelettrica è stata utilizzata per creare un’osteotomia in ratti Wistar e fu trovata da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e l’istologia per produrre molti meno danni rispetto a un tradizionale trapano odontoiatrico¹². Gli autori hanno concluso che la chirurgia piezoelettrica era sicura per la rimozione dell’osso vicino tessuto cerebrale morbido. Mouse, tuttavia, hanno una dura più sottile che è danneggiato più facilmente, e che lo studio non si prepara windows per imaging ottico cronica. Formazione immagine cronica richiede che i vasi sanguigni non siano danneggiati e che non formano coaguli di sangue sotto la finestra. Danni al dura conducono ad infiammazione che causa la finestra verso il cloud, e attiva le microglia e la proliferazione di astrociti reattivi. Qui abbiamo ottimizzato la chirurgia piezoelettrica per topi creare sia sottile teschio e ossa completo cranica windows rimozione adatto per l’imaging cronica. Abbiamo confrontato questa tecnica chirurgica agli ambulatori cranica finestra preparato con un trapano rotante ad alta velocità.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti secondo gli standard stabiliti dalla Columbia University Medical Center istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). L’eutanasia è stata eseguita tramite dislocazione cervicale in anestesia con ketamina 100 mg/kg e xilazina iniettato intraperitonealmente 10 mg/kg. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in modo sterile (chirurgo indossava tappo di testa, maschera viso, guanti sterili e camice da laboratorio monouso pulito) e strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell’autoclave tra ogni uso. 1. prechirurgiche passaggi Autoclave tutti gli strumenti chirurgici per garantire la sterilità. Anestetizzare topi C57bl6 con isoflurano (4% per induzione e 1.5-2% per la chirurgia). Pizzicare la punta posteriore ogni 10 min per assicurare la corretta profondità dell’anestesia. Aumentare l’anestesia se è visto ritrazione vocalizzazione o dell’arto. Applicare il lubrificante veterinario occhio agli occhi per evitare l’essiccazione. Rimuovere i capelli sopra il cuoio capelluto con un’applicazione di 3 min di gel per capelli rimozione o dalla rasatura con un rasoio elettrico. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica su un rilievo di riscaldamento o coperta di ricircolo acqua calibrato impostata su 38° C. Amministrare la buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per fornire l’analgesia prechirurgica. Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni alternati di clorexidina o betadine ed etanolo al 70% utilizzando un batuffolo di cotone con punta applicatore. Iniettare 100 mL di bupivacaine diluito 50% in soluzione salina sotto il cuoio capelluto per fornire l’anestesia locale. 2. piezoelettrico finestra cranica chirurgia Utilizzando strumenti chirurgici sterili in autoclave, rimuovere un cerchio di 1 cm del cuoio capelluto sopra il cranio di taglio con forbici chirurgiche in un modello circolare. Sollevare il cuoio capelluto fuori del cranio esponendo il tessuto periostio sopra l’osso. Utilizzare la punta del forcipe per raschiare l’osso esposto chiaro di qualsiasi tessuto restante del periostio. Questo è importante assicurare che il cemento dentale non cadrà più tardi. Impostare l’unità di chirurgia piezoelettrica a vibrare l’impostazione più bassa. Si noti che le impostazioni più alte possono rompere vasi sanguigni a causa di intense vibrazioni. Difficoltà la punta circolare sterile al manipolo.Nota: La punta circolare di 4 mm è adatta per interventi chirurgici. Il formato di punta grande contribuisce alla velocità della chirurgia come l’intera finestra può essere assottigliata simultaneamente. Riempire una siringa da 10 mL con ghiaccio freddo cerebrospinale artificiale (ACSF) e tenerlo in mano che non impugna il manipolo piezoelettrico. Irrigare il cranio di sgocciolatura ACSF da siringa il cranio ad un tasso di 1 mL/min in alternativa, utilizzare una pompa peristaltica, posizionata sopra il cranio per liberare l’uso di altra mano.Nota: Irrigazione con ACSF freddo è importante per prevenire il surriscaldamento dovuto all’attrito dalle vibrazioni ad alta frequenza. Applicare delicatamente la punta vibra chirurgica al cranio con un leggero movimento circolare (3 cerchi per 1 s) e sottile dell’osso alla profondità desiderata per eseguire una preparazione cranio sottile (5-10 min).Nota: Qui, windows 4 mm sono state fatte che sono state assottigliate a 20 µm. Tuttavia, la dimensione della finestra variano con la dimensione della punta chirurgica. Lo spessore dell’osso può essere regolata fino alla profondità desiderata in base alla lunghezza del tempo trascorso applicando la punta al cranio. Delicatamente, regolare l’angolazione del manipolo e cambiare l’angolo della punta, esercitando pressione al cranio per fluidificare il cranio uniformemente. Per eseguire una rimozione completa dell’osso senza lasciare alcun osso sottile dietro, sottile dell’osso fino a quando le crepe sono visibili intorno alla zona di finestra. Rimuovere le rimanenti scaglie di osso sottile con le pinzette senza danneggiare il sottostante dura. Immergere un pezzo di 1 mm di schiuma di collagene emostatico in ACSF freddo. Tenere la schiuma bagnata con una pinza e posizionarlo sul cranio sottile. Lasciare riposare sul cranio sottile per circa 30 s per interrompere qualsiasi micro sanguina in via di sviluppo. Utilizzare pinze per posizionare un coprioggetto in vetro 4 mm lateralmente sopra la finestra che è stata assottigliata nell’osso. Utilizzare il retro di un cotone piccolo di plastica o di legno con punta applicatore per applicare circa 100 µ l di acrilico dentale al cranio per tenere la finestra in posizione. 3. post chirurgico cura Rimuovere il mouse dall’apparato chirurgico e metterlo in una gabbia riscaldata per il recupero. Monitor continuamente fino a quando ha riguadagnato la coscienza completa (valutato da comportamento, andatura e mobilità normale). Valutare gli animali due volte al giorno per tre giorni per manifestazioni del dolore post-operatorio, compresa l’attività in diminuzione, toelettatura, cibo e consumo di acqua, custodire il comportamento (ad es. zoppicando o una postura ricurva) o aumentata aggressività. Non restituire l’animale per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. Amministrare la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea come un analgesico 8 – 12 h dopo l’intervento chirurgico per 3 giorni. Monitorare l’area della finestra molto attentamente dopo la chirurgia per deiscenza, infiammazione e segni di infezione. Se l’animale non tornare alla linea di base di alimentazione e governare i comportamenti, consultare un veterinario per quanto riguarda i possibili interventi o l’eutanasia.

Representative Results

Prima di procedere con la chirurgia piezoelettrica, rimuovere qualsiasi residuo periostio dal cranio. Una volta che il cranio è opaca e liscia (Figura 1a), il chirurgo può iniziare la chirurgia piezoelettrica. Durante la rimozione dell’osso con la punta piezo vibrante, è fondamentale per irrigare il cranio con il ghiaccio freddo ACSF. Corretta irrigazione è raggiunto quando il fondo 1 mm della punta è sommerso in ACSF (Figura 1b). Senza irrigazione adeguata, l’osso sarà surriscaldare e danneggiare il cervello. Dopo il cranio è stato assottigliato fino alla profondità desiderata, scelta dal chirurgo, ci potrebbe essere qualche residuo sanguinamento da vasi sanguigni situati nell’osso. Al fine di cessare rapidamente tutte le emorragie, applicare un pezzo piccolo di 1 mm di schiuma di collagene imbevuto di ACSF per l’area della finestra. Lasciate che il collagene sedersi sul cranio per circa 30 s (Figura 1C). Dopo la rimozione della schiuma di collagene, la finestra apparirà traslucida, che permette la chiara visualizzazione dei vasi sanguigni nella dura. La dura madre sarà intatta senza lividi significativi. (Figura 1D). Se la dura madre appaia rossa e infiammata, è probabile a causa di vasi sanguigni rotti da troppa pressione applicata alla punta durante l’intervento chirurgico. Per proteggere la nuova finestra e prepararlo per l’imaging cronica, vetrino coprioggetti devono essere posizionato sull’area. Correttamente applicata vetrino coprioggetti delicatamente si siedono in cima alla finestra e non causerà alcun danno alla zona. Il vetrino coprioggetti devono coprire l’intera finestra. Se il vetrino coprioggetti sono correttamente applicato al cranio, la finestra rimarrà traslucida sotto il vetro. Tutti i vasi sanguigni nella dura sarà ancora visibile (Figura 1e). Dentale acrilico deve essere applicato intorno il vetrino coprioggetti aderire definitivamente alla superficie del cranio. I bordi del coprivetrino vetro devono essere coperti anche in acrilico dentale (Figura 1f). Abbiamo trovato che la chirurgia piezoelettrica è in genere molto più veloce rispetto a una tradizionale finestra cranica, prendendo circa 10-12 min a chirurgia (Figura 2A). Abbiamo anche scoperto che c’erano meno complicazioni dovuto dura ecchimosi e sanguinamento come osservato dall’occhio (Figura 2B). Una finestra adeguatamente preparata vi permetterà multiphoton imaging di indicatori fluorescenti in neuroni corticali in vivo. Abbiamo scelto di immagine l’indicatore rosso del calcio JRGECO1a in corpi cellulari dei neuroni corticali di livello 4 (Figura 3A-3B). Abbiamo potuto osservare transitori del calcio in questi corpi delle cellule attraverso la finestra preparati utilizzando FASORE. Figura 1: la chirurgia piezoelettrica. (a) il cranio dopo che è stato preparato correttamente per FASORE. Tutto il tessuto periosteal è stato rimosso, lasciando una superficie liscia e pulita. (b) un’immagine rappresentativa del FASORE in corso. Parte inferiore 1 mm di vibrante punta chirurgica è sommerso in ghiaccio freddo ACSF. Il fluido viene applicato al cranio ad un tasso di 1 mL/min. Un leggero movimento circolare viene applicato al cranio e l’osso è assottigliata tramite vibrazioni ultrasoniche. (c) dopo il cranio è stato assottigliato, un pezzo circolare di 1 mm di schiuma di collagene bagnato freddo che ACSF si lascia riposare sulla finestra per interrompere qualsiasi micro sanguina dall’osso. (d), una finestra di successo con una dura traslucido vengono visualizzati tutti i vasi sanguigni intatti. Non c’è nessun danno visibile o ecchimosi sulla superficie del cervello. (e) un vetrino coprioggetti è posizionato sopra la finestra per proteggere la superficie del cervello. (f) dentale acrilico viene applicato al cranio per risolvere definitivamente il vetrino coprioggetti sopra la finestra. Scala bar 1 mm in tutte le immagini. Figura 2. Confronto del tasso di successo nella formazione per FASORE o dentali trapano chirurgia. (A) tempo medio per la chirurgia era inferiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (p < 0,05, due test t munito) n = 30 ambulatori per gruppo e media 10 interventi al chirurgo. (B) la percentuale di successo interventi chirurgici (definito come nessun danno visibile o sanguinamento al dura, come osservato dall’occhio del chirurgo attraverso l’obiettivo fissato a 350 zoom) era superiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (n = 30 ambulatori per ogni gruppo, uno test z munito). Barre di errore indicano SD Nella figura 3. Imaging in vivo attraverso una finestra cranica multifotonica diluito con FASORE. (A) calcio transitori osservati con l’indicatore rosso del calcio JRGECO1a erano imaged in neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia motoria murino in vivo. Barra della scala = 100 µm. (B), la stessa finestra ma diversa regione della corteccia di motore di livello 4. Headfixed mouse con finestra di 3mm preparato con FASORE. Barra della scala = 30 µm. Imaged con un microscopio multifotonica, obiettivo 40x, 1040 nm lunghezza d’onda di eccitazione.

Discussion

La chirurgia può essere modificata cambiando la punta chirurgica. Ci sono molti formati differenti della punta che possono essere applicati al manipolo. Modificare le dimensioni o la forma della punta si tradurrà in finestre di dimensioni diverse. Oltre la punta di 4 mm, abbiamo anche provato una punta di 3 mm e trovato che ha anche funzionato bene. Anche con irrigazione con ghiaccio freddo ACSF, non eravamo in grado di ottenere buoni risultati con le punte che erano troppo strette (circa 0,25 mm) a causa di vibrazioni concentrate causando troppo calore e bruciare l’osso conseguenti danni al sottostante dura. Non abbiamo provato la moltitudine di altri suggerimenti che sono disponibili, e ci aspettiamo che altri laboratori possono trovare nuove applicazioni per questi consigli diversi. Mentre la chirurgia è relativamente semplice, abbiamo trovato che ci sono diversi passaggi che potrebbero richiedere la risoluzione dei problemi. Il primo è che la punta vibra produce un sacco di turbolenza in ACSF, che diminuisce la visibilità e produce difficoltà nell’accertare la profondità dell’osso dell’osso assottigliamento passo della chirurgia. È consigliabile che se è troppo difficile vedere quanto l’osso è sottile, prenditi una pausa per asciugare il cranio e la finestra applicando un tampone di cotone sterile al lato dell’osso. Non applicare il tampone di cotone direttamente alla finestra, dal momento che la superficie ruvida è dannoso per osso sottile. Dopo aver controllato la profondità, è necessario riapplicare ACSF e continuare con la chirurgia. Abbiamo anche trovato che se c’è danno al dura, è solitamente dovuto il chirurgo mettere troppa pressione sulla punta. Tenendo il manipolo più delicatamente e applicare meno forza probabilmente risolverà questo problema. Se il chirurgo è forzatamente raschiando la punta sull’osso, esso causerà una pausa nell’osso sottile e danneggiare il cranio. Infine, se dopo aver assottigliamento dell’osso, il sottostante dura contuso, è probabilmente dovuto il calore in eccesso dalle vibrazioni. Aumento del tasso di flusso ACSF risolverà questo problema.

La limitazione principale di FASORE è che il manipolo può sottile dell’osso, ma non è possibile rimuovere tutte le ossa sopra la dura madre. La punta rivestita di diamante ha piccoli urti ruvide. Lo sfregamento serviva per fluidificare il cranio sarebbe carteggiare la dura madre e causare sanguinamento se esso venisse utilizzato per rimuovere tutte le ossa. Così, per rimuovere lo strato sottile restante è necessaria l’applicazione del forcipe. Mentre ci è dibattito continuo su se la formazione immagine attraverso un cranio sottile produce meno proliferazione di microglia e astrociti reattivi e meno infiammazione, in alcuni casi una finestra con nessun osso restante è preferita, ad esempio, per fornire una maggiore profondità di imaging³ .

Abbiamo ottimizzato la preparazione di finestra cranica per multiphoton imaging in topi. FASORE è, a nostra conoscenza, la prima applicazione della tecnica piezoelettrica per chirurgia cranica roditore finestra per imaging ottico. Troviamo che l’uso della chirurgia piezoelettrica in topi condivide i vantaggi di velocità aumentata e diminuita eventi avversi segnalati anche in esseri umani^7,8,9,10. L’utilizzo del dispositivo piezoelettrico è provocato da interventi chirurgici più veloce (Figura 2A) e meno eventi avversi di sanguinamento rispetto ad una rotativa ad alta velocità trapano (Figura 2B). Abbiamo anche trovato, all’interno del nostro laboratorio, che FASORE era più facile per i chirurghi di nuovi da imparare rispetto agli approcci tradizionali alla chirurgia cranica finestra. Vantaggi di velocità e facilità d’uso sono probabilmente diverse fra i chirurghi. Preparazioni di cranio sottili richiedono in genere 30-45 min per fluidificare l’osso con un trapano e bisturi², mentre l’approccio FASORE richiede in genere meno di 10 min.

Abbiamo trovato che in windows preparata con FASORE potremmo immagine transitori di calcio nei neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia di motore che era stato transfected con virus adeno associato codifica l’indicatore di calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Inoltre abbiamo trovato che, rispetto a una finestra cranica cranio sottile preparata con un trapano rotativo e bisturi, l’imaging regione era più grande, mentre un cranio sottile preparato con un trapano rotativo e bisturi ha una finestra di imaging 20 µm di diametro² . Con FASORE, siamo stati in grado di sottile rapidamente un’area di 3-4 mm. Questo è simile alla finestra di imaging segnalata con porte⁴. Questa finestra più grande conserva il vantaggio della rappresentazione rapida segnalato per windows cranio sottile preparata con un trapano odontoiatrico e bisturi. Inoltre, la finestra preparata con FASORE può essere imaged immediatamente, al contrario di rimozione dell’osso tradizionale windows che può richiedere settimane per guarire prima che la finestra può essere ottimamente ripreso³.

Questa tecnica può essere applicata per lo studio delle alterazioni del flusso sanguigno nei vasi sotto la dura madre. Un importante studio futuro è quello di confrontare il immunoreactivity di FASORE con altri metodi di finestra cranica. Questo sarebbe importante per determinare se il FASORE produce meno infiammazione rispetto a metodi esistenti. Ci auguriamo che la tecnica chirurgica piezoelettrica documentata qui permetterà altri labs eseguire windows cranica e utilizzare correttamente multifotonica imaging in vivo.

Assicurarsi che il manipolo è impostato a vibrare l’impostazione più bassa e che il ACSF è essere irrigato a una velocità costante. Il freddo di ghiaccio che ACSF deve essere applicato costantemente o si sarà riscaldare e danneggiare la dura madre. Abbiamo trovato che ACSF deve essere applicato a una velocità di almeno 1 mL/min. utilizzare una siringa tenuto in mano, o utilizzare una pompa peristaltica, piuttosto che l’irrigazione integrato nel manipolo. Il sistema di irrigazione nel manipolo espelle ACSF con troppa forza e produce troppa turbolenza, che significativamente alterare la visibilità.

Materials

Piezosurgery Touch	Mectron	5120062	Piezosurgery GP model has the same settings
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)	Mectron	3370019	This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.
Stereotax frame	Kopf	963
Mouse adaptor	Stoelting	51625
Peristaltic pump for irrigation.	Cole-Parmer	WU-77120-42	Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.
Avitene Ultrafoam	Bard-Davol	1050020	Important to stop any minor bleeding instantly.
C&B Metabond	Parkell	S380	Much stronger than regular dental acrylic.
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)	Tocris	3525
Puralube opthalmic ointment	Dechra	17033-211-38
Mice	JAX	664
Prairie Ultima multiphoton microscope	Olympus
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)	UPENN Vector Core