Summary
Piezoelektriska kirurgi har lett till förbättringar i människors käkkirurgi och dental kirurgi. Vi har utvecklat ett protokoll för att optimera piezoelektriska kirurgi för kraniala fönster kirurgi hos möss.
Abstract
Multiphoton mikroskopi har anpassats allmänt för imaging nervceller i vivo. Upprepade imaging kräver implantation av ett kranium fönster eller upprepad förtunning av skallen. Kraniella fönster kirurgi utförs normalt med en hög hastighet roterande borr, och många utredare finner det utmanande att förhindra att borren skada känsliga dura och blodkärl. Omfattande utbildning och praktik som krävs för att ta bort benet utan att skada underliggande vävnad och därmed kraniala fönster kirurgi kan vara svårt, tidskrävande och producera vävnadsskada. Piezoelektriska kirurgi, som används flitigt för käkkirurgi och dental kirurgi, använder tredjeparts ultraljud vibrationer för att ta bort ben utan att skada mjuka vävnader. Vi har utvecklat en metod som anknyter piezoelektriska kirurgi för att förbättra kraniala fönster kirurgi hos möss som förberedelse för multiphoton imaging. Jämförelser inom vårt lab tycker att metoden kräver mindre kirurgi tid och har en lägre genomsnittlig frekvens av komplikationer på grund av dural blödning än kraniala fönster kirurgi med en roterande borr.
Introduction
Kraniella fönster kirurgi inför multiphoton imaging i vivo gnagare har blivit en viktig teknik i neurovetenskap. Avlägsnas eller gallring av ben är nödvändigt att förbereda musen för optisk imaging med multiphoton Mikroskop. Denna operation utförs antingen genom att helt ta bort ett område av ben att exponera underliggande dura1, eller genom gallring en region av ben utan fullständig borttagning från dura2. Metoden med tunn skalle kan producera mindre inflammation och aktivering av mikroglia3 men ger en grundare djup Imaging, en mindre avbildning fönsterstorlek (200 µm) och en begränsad tidsperiod under vilken fönstret kan avbildas på grund av ben återväxt2 . Tillägg av ett polerat och förstärkt glasfönster (portar) kan öka imaging storlek och imaging period men är svårt att utföra4.
Både aktuella operationer använda en hög hastighet roterande borr tunna eller ta bort benet från skallen. Tunn skalle tekniken använder också en skalpell efter borren att ytterligare tunna ben2. Hamnar tekniken kräver det extra steget för hög hastighet polering med grus4. I en hög hastighet orsakar roterande borr, en luftdrivna turbin eller elmotor borrkronan att snurra med hög hastighet. Som roterande borrar avsnitt både ben och mjuk vävnad, finns det en risk för skada dura och underliggande blodkärl. Framgången av operation beror på skickligheten hos kirurgen. Förutom dessa windows förberett med mekaniska kirurgiska metoder, varit en kemisk metod av optiskt rensa skallen med olika lösningar utvecklade5,6. Eftersom piezoelektriska kirurgi är en mekanisk metod för kirurgi, kommer våra jämförelser här dock begränsas andra mekaniska metoder.
Piezoelektriska kirurgiska enheter använda ultraljud vibrationer att bryta ner mineraliserat ben utan att skada underliggande mjukdelar, och därmed erbjuda en metod för att snabbt tunna ett stort område av ben. I en piezoelektrisk kirurgiskt handstycke, turbinen ska ersättas med en stack av keramiska skivor och när nuvarande appliceras, diskarna vibrera vid ultraljud frekvenser. Vibrationerna överförs genom handstycket till diamant belagda tips att skära igenom ben utan skada mjuka vävnader, en fördel över roterande borrar som inte diskriminerar mellan vävnadstyper. Piezoelektriska kirurgi utvecklades ursprungligen för användning i mänskliga av Tomaso Vercellotti och har lett till förbättringar i tandvården och cranio-maxilofacial kirurgi7,8,9,10,11 .
Piezoelektriska kirurgi har använts för att skapa en osteotomi Wistar råttor och hittades av magnetisk resonanstomografi (MRT) och histologi att producera betydligt mindre skada än en traditionell tandvård borr12. Författarna drog slutsatsen att piezoelektriska kirurgi var säker för att ta bort benet nära mjuk hjärnvävnad. Möss, men har en tunnare dura som lättare skadas, och att studien förbereda inte windows för kronisk optisk imaging. Kronisk imaging kräver att blodkärlen inte är skadade och att blodproppar inte utgör under fönstret. Skador på dura leder till inflammation som orsakar fönstret till molnet, och aktiverar mikroglia och spridningen av reaktiva astrocyter. Här har vi optimerat piezoelektriska kirurgi för möss att skapa både tunna skalle och full ben borttagning kraniala windows lämplig för kronisk imaging. Vi jämförde denna operationsteknik till kraniala fönster operationer beredd med en hög hastighet roterande borr.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur utfördes enligt normerna som de Columbia University Medical Center institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC). Eutanasi utfördes via cervikal dislokation under anestesi med ketamin 100 mg/kg och xylazin 10 mg/kg injiceras intraperitonealt. Alla kirurgiska ingrepp utfördes på ett sterilt sätt (kirurg bär huvudet mössa, ansiktsmask, sterila handskar och ren disponibla labbrock) och kirurgiska verktyg var Ånghärdad mellan varje användning.
1. presurgical steg
- Autoklav alla kirurgiska instrument för att säkerställa steriliteten.
- Söva C57bl6 möss med isofluran (4% för induktion och 1,5-2% för kirurgi). Nypa hind tån var 10 minut för att säkerställa korrekt djup anestesi. Om läte eller bakben dementi ses öka anestesi.
- Gäller veterinärmedicinska öga smörjmedel för ögonen för att förhindra uttorkning.
- Ta bort håret över hårbotten med en 3 min ansökan hair removal gel eller rakning med en rakapparat.
- Placera musen i stereotaxic ramen på en värmedyna eller kalibrerad vatten recirkulerande filt anges till 38° C.
- Administrera buprenorfin (0,1 mg/kg) subkutant för att ge presurgical analgesi.
- Desinficera hårbotten med tre alternerande tillämpningar av klorhexidin eller betadine och 70% etanol med hjälp av en bomullstuss som tippade applikator.
- Injicera 100 mL bupivakain spädas 50% i saltlösning under hårbotten för att ge lokalbedövning.
2. piezoelektriska kraniala fönster kirurgi
- Ånghärdad sterila operationsinstrument loss med en 1 cm cirkel av hårbotten över skallen genom att skära med kirurgisk sax i ett cirkulärt mönster. Lyft i hårbotten av skallen utsätta periostet vävnaden över benet.
- Använd spetsen på tången för att skrapa den utsatt ben klara av eventuella återstående periostet vävnad. Detta är viktigt att säkerställa att dentala cement inte kommer lossna senare.
- Ställ in piezoelektriska kirurgi att vibrera på den lägsta inställningen. Observera att högre inställningar kan bryta blodkärl på grund av intensiva vibrationer.
- Fixa det sterila cirkulär tipset till handstycket.
Obs: 4 mm rund spets är väl lämpad för operationer. Den stora storleken bidrar till hastigheten på operationen eftersom hela fönstret kan förtunnas samtidigt. - Fyll en 10 mL spruta med is kallt konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) och håll den i handen som inte håller piezoelektriska handstycket.
- Vattna skallen av droppande ACSF från sprutan till skallen med en hastighet av 1 mL/min. Alternativt, Använd en Peristaltisk pump placerad över skallen för att gratis användning av den andra handen.
Obs: Bevattning med kall ACSF är viktigt för att förhindra överhettning på grund av friktionen från de högfrekventa vibrationerna. - Applicera försiktigt vibrerande kirurgiskt spetsen till skallen med lätta cirkelrörelser (3 cirklar per 1 s) och tunna ben till önskat djup att utföra en tunn skalle beredning (5-10 min).
Obs: Här, 4 mm windows gjordes som var tunnas att 20 µm. Storleken på fönstret kan emellertid variera med storleken på den kirurgiska spetsen. Tjockleken på benet kan justeras till önskat djup baserat på längden av tid tillämpa tipset på skallen. - Försiktigt justera vinkeln på handstycket och ändra vinkeln på spetsen tillämpar trycket i skallen att tunna skallen jämnt.
- För att utföra en komplett bone borttagning utan att lämna några tunna ben bakom, tunna ben tills sprickor syns runt fönsterytan. Ta bort återstående flingor av tunna ben med tången utan att skada underliggande dura.
- Blötlägg en 1 mm bit hemostatiska kollagen skum i kalla ACSF. Håll det våt skummet med pincett och placera den på tunna skallen. Låt det sitta på tunna skallen för omkring 30 s för att stoppa någon mikro blöder från att utvecklas.
- Använda pincett för att placera en 4 mm täckglas sidled över fönstret som har varit tunnats i benet.
- Använd baksidan av en liten plast eller trä bomull tippas applikator ska gälla skallen att hålla fönstret på plats ca 100 µL av dental akryl.
3. inlägget kirurgisk vård
- Ta bort musen från den kirurgiska apparaten och placera den i en uppvärmd bur för återvinning. Övervaka det kontinuerligt tills den har återfått fullt medvetande (bedömd med normal rörlighet, gånganalys och beteende).
- Bedöma djuren dagligen i tre dagar för manifestationer av postoperativ smärta inklusive minskad aktivitet, grooming, god mat och vattenförbrukning, vaktar beteende (t.ex. haltar eller en krökt kroppshållning) eller ökad aggression. Inte tillbaka djuret till företaget av andra djur tills det har återhämtat sig helt.
- Administrerar buprenorfin (0,05 – 0,1 mg/kg) subkutant som ett smärtstillande 8 – 12 timmar efter operationen för 3 dagar. Övervaka området i fönstret noga efter operation för sårruptur inflammation och tecken på infektion. Om djuret inte återgå till baslinjen utfodring och grooming beteenden, rådfråga en veterinär angående eventuella interventioner eller eutanasi.
Representative Results
Innan du fortsätter med piezoelektriska kirurgi, ta bort eventuella kvarvarande periostet från skallen. När skallen är ogenomskinlig och smidig (figur 1a), kirurgen kan börja piezoelektriska kirurgi. När du tar bort ben med vibrerande piezo spetsen, är det viktigt att spola skallen med is kallt ACSF. Korrekt bevattning uppnås när botten 1 mm spets är nedsänkt i ACSF (figur 1b). Utan korrekt bevattning, kommer att benet överhettas och skada hjärnan. Efter skallen har varit tunnats till önskat djup valt kirurgen, kan det finnas vissa kvarstående blödning från blodkärlen i benet. För att snabbt upphör samtliga blödningar, tillämpa en liten 1 mm bit kollagen skum indränkt i ACSF till området av fönstret. Låt kollagen sitta på skallen för cirka 30 s (figur 1 c). När kollagen skummet har tagits bort, visas fönstret genomskinligt, möjliggör tydlig visualisering av blodkärlen i dura. Dura kommer att vara intakt utan stora blåmärken. (Figur 1 d). Om dura visas röd och inflammerad, är det sannolikt på grund av trasiga blodkärl från för mycket tryck som spetsen under operationen. För att skydda det nya fönstret och förbereda den för kronisk imaging, måste ett täckglas placeras över området. En korrekt tillämpad täckglas försiktigt kommer att sitta på toppen av fönstret och kommer inte att orsaka någon skada till området. Täckglaset måste täcka hela fönstret. Om täckglaset tillämpas korrekt till skallen, förblir fönstret genomskinlig under glaset. Alla blodkärl i dura kommer fortfarande att vara synliga (figur 1e). Dental akryl måste appliceras runt täckglaset permanent följa det på ytan av skallen. Kanterna på täckglaset måste också täckas i dental akryl (figur 1f).
Vi hittade att piezoelektriska kirurgi är vanligtvis mycket snabbare än en traditionell kraniala fönstret, tar runt 10-12 min per kirurgi (figur 2A). Vi fann också att det fanns mindre komplikationer på grund av dura blåmärken och blödning såsom öga (figur 2B). En väl förberedd fönster gör att multiphoton avbildning av fluorescerande indikatorer i kortikala nervceller i vivo. Vi valde att bild indikatorn rött kalcium JRGECO1a i cellen organ lager 4 kortikala nervceller (figur 3A-3B). Vi kunde observera kalcium transienter i dessa cell organ genom fönstret tillagas med PHASOR.
Figur 1: piezoelektriska kirurgi. (en) skallen efter det förberetts ordentligt för PHASOR. Alla periost vävnad har avlägsnats, lämnar en len och ren yta. (b) en representativ bild av PHASOR pågår. Botten 1 mm av den vibrerande kirurgiskt tip är nedsänkt i is kallt ACSF. Vätskan tillämpas på skallen med en hastighet av 1 mL/min. En lätta cirkelrörelser appliceras på skallen och benet är vattenlöslig via ultraljud vibrationer. (c) efter skallen har varit tunnats, en 1 mm cirkulär bit av kollagen skum indränkt i kalla ACSF får vila på fönstret för att stoppa någon mikro blödningar från benet. (d) ett framgångsrikt fönster med en genomskinlig dura visar alla intakta blodkärl. Det finns inga synliga skador eller blåmärken på ytan av hjärnan. (e) ett täckglas placeras över fönstret för att skydda ytan av hjärnan. (f) Dental akryl tillämpas på skallen att permanent åtgärda täckglaset över fönstret. Skala bar 1 mm i alla bilder.
Figur 2. Jämförelse av framgång i utbildning för PHASOR eller dental borra kirurgi. (A) Genomsnittlig tid per operation var lägre för PHASOR än dental borr operationer (p < 0,05, två tailed t test) n = 30 operationer per grupp och i genomsnitt 10 operationer per kirurg. (B) andelen framgångsrika operationer (definierat som ingen blödning eller synlig skada dura såsom kirurgens ögat genom målet att 350 X zoom) var högre för PHASOR än dental borr operationer (n = 30 operationer för varje grupp, en tailed z-test). Felstaplar visar SD.
Figur 3. Multiphoton imaging i vivo genom ett kraniala fönster förtunnas med PHASOR. (A) kalcium transienter som observerats med indikatorn rött kalcium JRGECO1a var avbildade i lager 4 pyramidal nervceller i murina motoriska cortex i vivo. Skalstapeln = 100 µm. (B), samma fönster men annan region i lager 4 motor cortex. Headfixed mus med 3 mm fönster beredd med PHASOR. Skalstapeln = 30 µm. Imaged med multiphoton Mikroskop, 40 X-objektiv, 1040 nm excitation våglängd.
Discussion
Operationen kan ändras genom att ändra den kirurgiska spetsen. Det finns många olika storlekar av spets som kan tillämpas på handstycket. Ändra storlek eller form av spetsen kommer att resultera i olika stora fönster. Förutom 4 mm spets, vi också försökt en 3 mm spets och fann det också fungerat väl. Även med bevattning med is kallt ACSF, vi var inte kunna få bra resultat med tips som var för trång (cirka 0,25 mm) på grund av koncentrerad vibrationer orsakar alltför mycket värme och brännande ben leder till skada för att underliggande dura. Vi har inte försökt mängden andra tips som är tillgängliga och vi räknar med att andra labb kan hitta nya tillämpningar för dessa olika tips. Operationen är relativt enkelt, hittade vi att det finns flera steg som kräver felsökning. Först är att den vibrerande spetsen producerar en hel del turbulens i den ACSF, vilket minskar synligheten och producerar svårigheter i att fastställa ben djup under ben gallring steg i operationen. Vi rekommenderar att om det är svårt att se hur tunn benet är, ta en paus för att torka skallen och fönster genom att tillämpa en steril bomullspinne till sidan av benet. Gäller inte bomullstuss direkt till fönstret, eftersom den grova ytan är skadligt för tunna ben. Efter kontroll djupet, återapplicera ACSF och fortsätta med operationen. Vi fann också att om det finns skador på dura, det är oftast på grund av kirurgen att sätta för mycket press på spetsen. Holding handstycket mer skonsamt och tillämpa mindre kraft kommer sannolikt att åtgärda problemet. Om kirurgen är med våld skrapning spetsen på benet, kommer det orsaka ett avbrott i den tunna ben och skada skallen. Slutligen om underliggande dura visas efter gallring ben, blåmärken, troligtvis på grund av överskottsvärme från vibrationer. Ökande ACSF flödet kommer att fixa problemet.
Den största begränsningen av PHASOR är att handstycket kan tunna ben, men kan inte ta bort alla ben över dura. Diamant belagda spetsen har små grov knölar. Gnuggbilden behövs att tunna skallen skulle slipa dura och orsaka blödning om det användes för att ta bort alla ben. Att ta bort återstående tunna lager krävs således användningen av tången. Medan det finns pågående debatt om huruvida imaging genom en tunn skalle producerar mindre inflammation och mindre spridning av mikroglia och reaktiva astrocyter, i vissa fall är ett fönster med inga ben kvar att föredra, t.ex., att ge ett större djup imaging3 .
Vi har optimerat kraniala fönster förberedelse för multiphoton imaging i möss. PHASOR är, att vår kunskap, den första tillämpningen av piezoelektrisk teknik till gnagare kraniala fönster kirurgi för optisk imaging. Finner vi att användningen av piezoelektriska kirurgi hos möss delar fördelarna med ökad hastighet och minskade biverkningar rapporterade också människor7,8,9,10. Utnyttjande av piezoelektriska enheten resulterade i snabbare operationer (figur 2A) och färre biverkningar för blödning jämfört med en höghastighets rotary borra (figur 2B). Vi hittade också, inom våra lab, att PHASOR var lättare för nya kirurger att lära än traditionella metoder för kraniala fönster kirurgi. Fördelarna med hastighet och användarvänlighet är sannolikt att skilja sig bland kirurger. Tunn skalle preparat kräver normalt 30-45 min till tunna benet med en borr och skalpell2, medan den PHASOR metoden kräver vanligen mindre än 10 min.
Vi hittade att i windows förberett med PHASOR kunde vi bilden kalcium transienter i lager 4 pyramidal nervceller i motor cortex som hade transfekterats med adeno associerade virus kodning indikatorn kalcium JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Vi fann också att, jämfört med en tunn skalle kraniala fönster beredd med en roterande borr och skalpell, imaging regionen var större, medan en tunn skalle beredd med en roterande borr och skalpell har en tänkbar fönster av 20 µm diameter2 . Med PHASOR kunde vi snabbt tunna en yta på 3-4 mm. Detta liknar fönstret imaging rapporterade med portar4. Denna större fönster behåller fördelen snabba imaging rapporterade för tunn skalle windows förberett med en dental borr och skalpell. Dessutom fönstret förberett med PHASOR kan avbildas omedelbart, i motsats till traditionella bone borttagning windows som kan kräva veckor att läka innan fönstret kan vara optimalt avbildas3.
Denna teknik kan användas för att studera förändringar i blodflöde i kärlen under dura. En viktig framtida studie är att jämföra immunoreaktivitet av PHASOR med andra metoder av kraniala fönster. Det skulle vara viktigt att avgöra om PHASOR producerar mindre inflammation jämfört med befintliga metoder. Vi hoppas att den piezoelektriska operationsteknik som dokumenteras här gör mer labs att utföra kraniala windows och framgångsrikt använda multiphoton imaging i vivo.
Kontrollera att handenheten är inställd att vibrera på den lägsta inställningen och att ACSF är att vara bevattnade med en konstant hastighet. Den iskall ACSF måste tillämpas ständigt eller det kommer att värma upp och skada dura. Vi hittade att ACSF måste tillämpas med en hastighet av minst 1 mL/min. antingen använda en spruta hålls i handen, eller använda en Peristaltisk pump, i stället för inbyggd bevattning i handstycket. Bevattningssystemet i handstycket matar ut ACSF alltför kraftfullt och producerar för mycket turbulens, vilket avsevärt kommer att försämra sikten.
Disclosures
Det finns inga upplysningar.
Acknowledgments
Tamara Zeric för att hjälpa till att uppnå multiphoton bild i denna uppsats. Stöds av hjärnan & beteende, Parkinson och JPB stiftelser, R01 MH108186 och R01 DA07418. F31 gemenskap 1F31MH109293-01A1 S c.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
| Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
| Stereotax frame | Kopf | 963 | |
| Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
| Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
| C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
| Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
| Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Mice | JAX | 664 | |
| Prairie Ultima multiphoton microscope | Bruker | ||
| JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |
References
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice. Nat protoc. 12, 213-220 (2010).
- Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing. Laser Physics Letters. 9, (2012).
- Yang, X., et al. Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging. IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).
- Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).
- Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure. Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).
- Vercellotti, T., Podesta, A. Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).
- Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. Piezoelectric surgery in implant dentistry. Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).
- Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction. J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).
- Pavlikova, G., et al. Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model. Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).
