Piezo yüksek doğruluk cerrahi Osteal kaldırma (FAZÖR): Farelerde geliştirilmiş kafatası pencere ameliyat için bir teknik

Summary

Piezoelektrik cerrahi insan çene ve diş cerrahi gelişmeler yol açmıştır. Piezoelektrik ameliyat farelerde beyin pencere ameliyatı için en iyi duruma getirmek için bir protokol geliştirdik.

Abstract

Multiphoton mikroskobu nöronlar vivo içindegörüntüleme için yaygın olarak adapte edilmiş. Tekrarlanan görüntüleme implantasyon kafatası bir pencerenin veya tekrarlanan kafatası inceltme gerektirir. Kafatası pencere cerrahi genellikle yüksek hızlı döner matkap ile gerçekleştirilir ve birçok müfettişler matkap hassas dura ve kan damarları zarar önlemek için zor bulmak. Kapsamlı bir eğitim ve uygulama kemik alttaki dokuya zarar vermeden kaldırmak için gereklidir ve böylece kafatası pencere cerrahi zor, zaman alıcı ve doku hasarı üretmek. Çene ve diş cerrahi için yaygın olarak kullanılır, piezoelektrik ameliyat kemik yumuşak dokulara zarar vermeden kaldırmak için ultrasonik titreşimler kullanır. Kafatası pencere ameliyat multiphoton görüntüleme için hazırlık farelerde geliştirmek için Piezoelektrik cerrahi uygulama bir yöntem geliştirdik. Karşılaştırmalar laboratuarımızın içinde yöntemi daha az ameliyat süresi gerektirir ve daha düşük bir ortalama oranı dural kafatası pencere ameliyat döner bir matkapla kanama nedeniyle komplikasyonların vardır bulmak.

Introduction

Kemirgenler multiphoton vivo içinde görüntüleme için hazırlamak için kafatası pencere ameliyat nörolojik önemli bir teknik haline gelmiştir. Kaldırma ya da kemiğin inceltme fare optik görüntüleme için multiphoton mikroskopla hazırlamak gereklidir. Bu ameliyat kemik alttaki dura¹ortaya çıkarmak için bir bölümünü tamamen kaldırarak veya kemik dura²tam kaldırma olmadan bölge inceltme gerçekleştirilir. İnce kafatası yaklaşım daha az inflamasyon ve microglia³ aktivasyonu oluşturabilir ancak görüntüleme, daha küçük bir resim pencere boyutu (200 µm) ve sınırlı bir süre sırasında pencerenin kemik büyütme^{2 nedeniyle görüntüsü bir sığ derinlik sağlar} . Cilalı ve güçlendirilmiş cam pencere (bağlantı noktaları) eklenmesi görüntüleme boyutunu ve görüntüleme süresini artırabilir ama⁴gerçekleştirmek zordur.

Geçerli her iki cerrahi bir yüksek hızlı döner tatbikat ince veya kafatasından kemik kaldırmak için kullanın. İnce kafatası tekniği bir neşter matkap sonra ilave ince kemik²için de kullanır. Bağlantı noktaları teknik yüksek hızlı kum⁴ile parlatma fazladan adım gerektirir. Yüksek bir hızda döner matkap, bir güç hava türbini veya elektrik motoru matkap yüksek bir hızda dönmeye neden olur. Döner matkaplar bölüm kemik ve yumuşak doku gibi beyin zarı zarar ve kan damarları temel riski vardır. Ameliyat başarısı cerrah yeteneklerinize bağlıdır. Mekanik cerrahi yöntemlerle hazırlanan bu windows ek olarak gelişmiş^5,6optik farklı çözümler ile kafatası açıklığın kimyasal bir yöntem olmuştur. Piezoelektrik cerrahi cerrahi mekanik bir yöntemdir, ancak, bizim karşılaştırma diğer mekanik yöntemler sınırlı olabilir.

Piezoelektrik cerrahi cihazlar ultrasonik titreşimler mineralize kemik zarar verici temel yumuşak doku olmadan yıkmak için kullanmak ve böylece hızla kemik geniş bir alanda ince bir yaklaşım sunuyoruz. Piezoelektrik bir cerrahi el probu, türbin seramik diskler yığını tarafından değiştirilir ve akım uygulandığında, diskler ultrasonik frekansları titreşimle. Titreşimleri probundan olmadan zarar yumuşak doku, kemik doku türleri arasında ayırımcılık değil döner matkaplar üzerinde bir avantaj ile kesmek için kaplamalı ipuçları elmas için transfer edilir. Piezoelektrik cerrahi aslında insan olarak kullanılmak üzere Tomaso Vercellotti tarafından geliştirildi ve diş gelişmeler ve Kraniyo-maxilofacial ameliyat^{7,8,9,10,11 yol açmıştır} .

Piezoelektrik cerrahi bir osteotomi de, Wistar fareler oluşturmak için kullanılan ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve geleneksel diş matkap¹²‘ den önemli ölçüde daha az hasar üretmek için Histoloji tarafından bulundu. Yazarlar piezoelektrik ameliyat kemik yumuşak beyin dokusu yakınındaki kaldırmak için güvenli olduğu sonucuna vardı. Fareler, ancak, daha kolay zarar görmüş bir ince dura var ve bu çalışma windows kronik optik görüntüleme için hazırlamak değildi. Kronik görüntüleme kan damarları zarar görmediğinden ve kan pıhtıları pencerenin altındaki oluşturmaz gerektirir. Beyin zarı zarar yol açar penceresi bulut inflamasyon ve microglia ve reaktif astrocytes yayılması etkinleştirir. Burada piezoelektrik ameliyat fareler ince kafatası ve tam kemik kaldırma kafatası windows kronik görüntüleme için uygun oluşturmak için optimize edilmiş. Biz bir yüksek hızlı döner matkap ile hazırlanan kafatası pencere ameliyatları bu cerrahi tekniğe göre.

Protocol

Tüm yordamlar içeren hayvanlar standartlara göre gerçekleştirilen Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ayarlayın. Ötenazi ketamin ile anestezi altında servikal çıkığı üzerinden gerçekleştirilen 100 mg/kg ve xylazine 10 mg/kg intraperitoneally enjekte. Tüm cerrahi işlemler steril bir şekilde gerçekleştirilmiştir (cerrah baş kap, yüz maskesi, steril eldiven ve temiz tek kullanımlık önlük giymişti) ve cerrahi araçlar arasındaki her kullanım autoclaved. 1. presurgical adımları Otoklav kısırlık emin olmak için tüm cerrahi aletler. C57bl6 fareler isoflurane (indüksiyon için % 4 ve ameliyat için % 1.5-2) ile anestezi. Arka ayak her 10 min uygun anestezi derinliği sağlamak için çimdik. Eğer konser veya arka bacak retraksiyon anestezi artırın. Veteriner göz yağ kurutma önlemek için gözler için geçerlidir. Saç saç temizleme jeli veya tıraş Tıraş ile 3 dk uygulama ile kafa derisi üzerinde kaldırın. Yer bir Isıtma yastığı veya battaniye seti 38 ° C’ye recirculating kalibre edilmiş su stereotaksik çerçeve içinde fare Subkutan presurgical analjezi sağlamak için buprenorfin (0.1 mg/kg) yönetmek için. Klorheksidin veya betadin ve % 70 etanol aplikatör uçlu bir pamuk kullanarak üç alternatif uygulamaları ile kafa derisi dezenfekte. Serum lokal anestezi sağlamak için kafa derisi altında seyreltilmiş bupivacaine 100 mL enjekte. 2. piezoelektrik kafatası pencere cerrahi Autoclaved steril cerrahi aletler kullanarak, kafa derisi 1 cm çemberi bir dairesel düzende Cerrahi makas ile kesme tarafından kafatası kaldırın. Kafa derisi kapaklarini doku kemik üzerinde açığa kafatası kapalı kaldırın. Pens ucu maruz kalan herhangi bir kapaklarini dokusunun açık kemik kazımak için kullanın. Bu diş çimento daha sonra düşmeyecek sağlamak önemlidir. En düşük ayarda titreşimle piezoelektrik cerrahi birimini ayarlayın. Daha yüksek ayarları yoğun titreşim nedeniyle kan damarlarının break unutmayın. Düzeltmek için el prob steril Dairesel ucu.Not: 4 mm Dairesel ucu ameliyatları için uygundur. Pencerenin tümünü aynı anda inceltilerek gibi büyük uç boyutu ameliyat hız için katkıda bulunur. Bir 10 mL şırınga buz soğuk yapay serebrospinal sıvı ile (ACSF) doldurmak ve el piezoelektrik el probu tutarak değil tutun. Alternatif olarak ACSF üzerine 1 mL/dk. hızında kafatası şırıngadan damlama tarafından kafatası sulamak, kafatası üzerinde konumlandırılmış bir Peristaltik pompa diğer el kullanımı ücretsiz için kullanın.Not: Sulama soğuk ACSF ile gelen yüksek frekanslı titreşimleri sürtünme nedeniyle aşırı ısınmayı önlemek önemlidir. Kafatası ile hafif dairesel hareketlerle hafifçe titreşimli cerrahi uç uygulamak (3 daire başına 1 s) ve ince ince kafatası hazırlık (5-10 dk) gerçekleştirmek için istenen derinlik kemiğe.Not: Burada, bunun için 20 µm inceltilerek 4 mm windows yapılmıştır. Ancak, pencerenin boyutunu cerrahi uç boyutu ile değişir. Kemik kalınlığı için harcanan süre kafatası için belgili tanımlık uç uygulama göre istenen derinlik ayarlanabilir. Yavaşça el prob açısı ayarlamak ve kafatası düzgün ince için kafatası basıncı uygulanırken ucu açısını değiştirmek. Herhangi bir ince kemik geride bırakmadan tam kemik kaldırma işlemini gerçekleştirmek için kemik ince çatlaklar pencere alanının görünür hale gelene kadar. İnce kemik kalan pul Forseps ile alttaki dura zarar vermeden kaldırmak. 1 mm biteviye-in Kan durdurucu sargı kollajen köpük soğuk ACSF emmek. Islak köpük Forseps ile tutun ve ince kafatasında yerleştirin. Yaklaşık 30 için ince kafatası oturmak izin herhangi bir mikro durdurmak için s kanamaları gelişmekte olan. Forseps kemiğin içine inceltilerek penceresi üzerinde 4 mm cam coverslip yanal eklemenizi sağlar. Küçük bir plastik veya ahşap pamuklu aplikatör uçlu arka pencere tutmak için kafatasının yaklaşık 100 µL diş akrilik uygulamak için kullanın. 3. sonrası cerrahi bakım Fare cerrahi cihaz kaldır ve kurtarma için ısıtmalı bir kafeste yerleştirin. Monitör sürekli kadar (normal hareketlilik, yürüyüş ve davranış tarafından değerlendirildi) tam bilinci yerine geldi. Hayvanlar günde iki kez ameliyat sonrası ağrı azalmış aktivite, damat, yiyecek ve su tüketimi, davranış (aksakörneğin veya bir Kambur duruş) koruma veya saldırganlık artar da dahil olmak üzere belirtileri için üç gündür değerlendirmek. Tamamen iyileşmiş kadar hayvan diğer hayvanlar şirkete iade etmeyin. Buprenorfin yönetmek (0,05-0,1 mg/kg) subkutan olarak bir analjezik 8 – 12 h ameliyattan 3 gün sonra. Yakından takip ameliyat yırtılması, inflamasyon ve Enfeksiyon belirtileri için pencerenin alanını izleyin. Hayvan besleme ve davranışları damat taban çizgisine döndürmezse, olası müdahaleler veya ötenazi ile ilgili bir veteriner danışın.

Representative Results

Piezoelektrik cerrahi ile devam etmeden önce herhangi bir kalıntı kapaklarini kafatasından kaldırın. Kafatası opak ve pürüzsüz bir kez (Şekil 1a), cerrah piezoelektrik cerrahi başlayabilir. Kemik titreşimli piezo ucu kaldırırken, bu kafatası buz ile sulamak için önemlidir soğuk ACSF. Alt uç 1 mm ACSF (Şekil 1b) batık zaman uygun sulama elde edilir. Uygun sulama kemik ısınmak ve beyin zarar. Kafatası cerrah tarafından seçilen istenen derinliğe inceltilerek sonra olabilir kan kemik bulunan gemiler artık bir kanama. Hızla tüm kanamayı durdurma, kollajen köpük bir küçük 1 mm parça uygulamak için alanı penceresi içinde ACSF batırılmış. Kollajen yaklaşık 30 için kafatası oturmak izin s (şekil 1 c). Kollajen köpük kaldırıldıktan sonra pencereyi yarı saydam, kan damarlarının açık görselleştirme dura içinde izin görünür. Beyin zarı önemli morarma olmadan olduğu gibi olacak. (Şekil 1 d). Beyin zarı kırmızı ve iltihaplı görüntülenirse, kırık kan damarları üzerinden ucuna kadar ameliyat sırasında uygulanan çok fazla baskı nedeniyle muhtemeldir. Yeni pencere korumak ve kronik görüntüleme için hazırlamak için bir cam coverslip alanın üzerinde yerleştirilmelidir. Düzgün uygulamalı cam coverslip yavaşça pencerenin üstüne oturur ve alanına herhangi bir zarar değil. Cam coverslip tüm pencereyi kapatmalı. Cam coverslip düzgün kafatası uygulanırsa, pencere saydam cam altında kalacaktır. Beyin zarı tüm kan damarlarının görülebilir (şekil 1e) olmaya devam eder. Diş akrilik kafatası yüzeye kalıcı olarak bağlı kalmak için cam coverslip etrafında uygulanması gerekir. Cam coverslip kenarlarını da diş akrilik (şekil 1f) kaplı olmalıdır. Piezoelektrik cerrahi genellikle geleneksel bir kafatası penceresinden daha çok daha hızlı ameliyat (şekil 2A) yaklaşık 10-12 dk alarak bulundu. Ayrıca daha az komplikasyonlar nedeniyle morarma ve göz (2B rakam) tarafından gözlemlediği gibi kanama dura olduğunu bulduk. Düzgün hazırlanmış bir pencere floresan göstergelerin multiphoton görüntüleme kortikal nöronlar içinde vivoiçinde sağlayacaktır. Katman 4 kortikal nöronların hücre organlarında kırmızı kalsiyum göstergesi JRGECO1a görüntü seçtik (şekil 3A-3B). Bu hücre organları pencereden FAZÖR kullanılarak hazırlanan kalsiyum geçişler gözlemlemek. Şekil 1: piezoelektrik ameliyat. (bir) düzgün FAZÖR için hazırlanmış olup sonra kafatası. Düzgün ve temiz bir yüzey bırakarak periosteal doku kaldırıldı. (b) FAZÖR temsilcisi bir görüntü devam ediyor. Alt cerrahi uç buzun içinde sular altında titreşimli, 1 mm soğuk ACSF. Sıvı 1 mL/dk hızında kafatası uygulanır. Hafif dairesel hareketlerle kafatası uygulanır ve kemik yolu ile ultrasonik titreşimler inceltilerek. (kafatası inceltilerek sonrac), 1 mm dairesel biteviye-in kolajen köpük soğuk ACSF kemik üzerinden herhangi bir mikro kanamaları durdurmak için pencerenin üzerinde dinlenmek için izin batırılmış. (d) A başarılı pencere saydam dura ile olduğu gibi kan damarlarının görüntüler. Görünür bir hasar veya beyin yüzeyine morarma var. (e) bir cam coverslip beyin yüzeyini korumak için penceresi üzerinde yer alıyor. (f) diş akrilik cam coverslip penceresi üzerinde kalıcı olarak düzeltmek için kafatasını uygulanır. Ölçek 1 mm tüm resimler bar. Şekil 2. Başarı oranı eğitim FAZÖR veya diş karşılaştırılması cerrahi matkap. (A)cerrahi başına ortalama saat diş matkap ameliyatları FAZÖR için alt (p < 0,05, iki kuyruklu t Testi) n = grubu başına 30 ameliyatları ve 10 ameliyat cerrah başına ortalama. (B) başarılı ameliyatlar (dura hasar yok kanama veya görünür olarak 350 X zoom ayarlamak amacı cerrahın gözünden tarafından gözlenen olarak tanımlanan) yüzdesi diş matkap ameliyatları FAZÖR için daha yüksek (n = 30 ameliyat her grup için bir kuyruklu z testi). SD hata çubuklarını göster Şekil 3. Vivo kafatası bir pencereden görüntüleme multiphoton FAZÖR ile inceltilerek. (A)kalsiyum kırmızı kalsiyum göstergesiyle JRGECO1a gözlenen geçişler içinde fare motor korteks içinde vivokatman 4 piramidal nöronların görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 µm. (B) aynı pencerede ancak katman 4 motor korteksin farklı bölge. Headfixed fare FAZÖR ile hazırlanan 3 mm pencere ile. Ölçek çubuğu = 30 µm. yansıma multiphoton mikroskop ile 40 X amaç, 1040 nm uyarma dalga boyu.

Discussion

Ameliyat cerrahi uç tarafından değiştirilebilir. El probu için uygulanabilir uç çok farklı boyutları vardır. Boyutunu veya şeklini uç değiştirme farklı ölçekli pencerelerde neden olur. 4 mm ipucu ek olarak Ayrıca güvenilir 3 mm uç ve aynı zamanda iyi çalıştı bulundu. Hatta ile sulama buz ile soğuk ACSF, biz çok (yaklaşık 0,25 mm) konsantre titreşimler neden çok fazla ısı ve zarar için alttaki dura önde gelen kemik yakma nedeniyle dar olduğunu ipuçları ile iyi sonuçlar elde etmek mümkün değildi. Biz-si olmak değil güvenilir kullanılabilir diğer ipuçları çok sayıda ve biz diğer labs yeni uygulamalar için farklı ipuçlarını bulabilirsiniz bekliyorlar. Ameliyat nispeten basit olmakla birlikte, sorun giderme gerekebilir birkaç adım vardır bulundu. Titreşimli ipucu bir sürü görünürlüğü azalır ve kemik derinlik adım cerrahinin inceltme kemik sırasında ascertaining zorluk üreten ACSF, türbülans üretir ilkidir. Ne kadar ince kemik olduğunu görmek, kafatası ve pencere kemik kenarına bir steril pamuklu çubukla uygulayarak kuru bir mola çok zor geldiğinde önerilir. Pütürlü yüzeyi ince kemiğe zarar beri pamuklu çubukla doğrudan penceresine, geçerli değildir. Derinliği kontrol sonra ACSF yeniden uygulayın ve cerrahi ile devam edin. Ayrıca beyin zarı hasar varsa, bu genellikle ucunda çok fazla baskı cerrah nedeniyle olduğunu bulduk. Büyük olasılıkla daha nazikçe el probu holding ve daha az kuvvet uygulayarak bu sorunu çözecektir. Cerrah zorla kemik ucunda kazıma, ince kemik bir ara neden ve kafatası zarar. Kemik inceltme sonra alttaki dura çürük görüntülenirse, son olarak, bu titreşimler aşırı ısı nedeniyle muhtemeldir. ACSF akış oranı artan bu sorunu çözecektir.

Ana FAZÖR el probu kemik ince, ancak tüm kemik üzerinde dura kaldıramazsınız kısıtlamasıdır. Elmas kaplamalı ucu küçük kaba diken diken vardır. Kafatası ince için gerekli sürtünme dura aşındırmak ve tüm kemik kaldırmak için kullanıldıysa kanamaya neden. Böylece, forseps kullanımına kalan ince bir tabaka kaldırmak için gereklidir. Görüntüleme ince bir kafatası ile daha az inflamasyon ve microglia ve reaktif astrocytes daha az yaygın üretir devam eden tartışmalar sırasında bazı durumlarda hiçbir kemik kalan bir pencere Örneğin,^{3 görüntüleme daha büyük bir derinlik sağlamak için tercih edilen,} .

Kafatası pencere hazırlık farelerde multiphoton görüntüleme için optimize edilmiş. FAZÖR, bilgimizi, kemirgen kafatası pencere ameliyat optik görüntüleme için ilk uygulamaya piezoelektrik tekniği var. Farelerde piezoelektrik cerrahi kullanımı artan hız avantajları paylaşır ve insanlar^7,8,9,10‘ da bildirilen advers azalmıştır bul. Piezoelektrik cihaz kullanımı daha hızlı ameliyat (şekil 2A) sonuçlandı ve yüksek hızlı bir rotary karşılaştırıldığında kanama daha az olumsuz olayları (şekil 2B) matkap. Ayrıca, laboratuarımızın içinde FAZÖR kafatası pencere cerrahi geleneksel yaklaşımlar daha öğrenmek yeni cerrahlar için daha kolay bulduk. Avantajları hız ve kullanım kolaylığı cerrahlar arasında farklılık muhtemeldir. İnce kafatası hazırlıklar genellikle 30-45 dk FAZÖR yaklaşım genellikle az 10 dk gerektirir iken kemik matkap ve neşter², ince gerektirir.

Windows FAZÖR ile hazırlanan biz kalsiyum göstergesi JRGECO1a kodlama ilişkili adeno virüs ile transfected motor korteks katman 4 piramidal nöronların kalsiyum geçişler resim bulduk (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). bu, ayrıca bulduk bir döner matkap ve neşter ile hazırlanan bir ince kafatası kafatası pencere karşılaştırıldığında, görüntüleme bölge döner bir matkapla hazırlanmış ince bir kafatası ise daha büyük ise ve neşter 20 µm çapı^{2 bir görüntüleme penceresi} . FAZÖR ile hızlı bir şekilde 3-4 mm bir alan ince başardık. Bu bağlantı noktaları⁴ile rapor görüntüleme penceresi benzer. Bu büyük pencere hızlı görüntüleme için bir diş matkap ve neşter ile hazırlanmış ince kafatası windows rapor parası korur. Ayrıca, FAZÖR ile hazırlanan pencere hemen görüntüsü, geleneksel kemik kaldırma karşı³hafta önce pencerenin en iyi şekilde olabilir iyileşmek için gerektirebilir windows görüntüsü.

Bu teknik, beyin zarı altında damarlarında kan akımı değişiklikleri incelemek için uygulanabilir. Önemli bir gelecekteki çalışma FAZÖR immunoreactivity kafatası penceresinin diğer yöntemlerle karşılaştırmaktır. Bu FAZÖR varolan yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha az iltihap üretir eğer belirlemek önemli olacaktır. Biz burada belgelenmiş piezoelektrik cerrahi tekniğin kafatası windows gerçekleştirmek ve başarılı bir şekilde multiphoton içinde vivogörüntüleme kullanmak daha fazla labs sağlayacak umuyoruz.

El probu en düşük ayarda titreşimle ayarlanır ve ACSF sabit bir oranda sulu olduğunu doğrulayın. ACSF sürekli uygulanması gereken buz soğuk veya bu kadar ısı ve beyin zarı zarar. Bulduğumuz ACSF en az 1 mL/her iki kullanım bir şırınga elinde tutulan veya yerleşik sulama yerine Peristaltik pompa el probu içinde kullanın dk. oranında uygulanması gerekir. El probu sulama sisteminde de zorla ACSF çıkarır ve görünürlüğünü önemli ölçüde zarar çok fazla türbülans üretir.

Materials

Piezosurgery Touch	Mectron	5120062	Piezosurgery GP model has the same settings
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)	Mectron	3370019	This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.
Stereotax frame	Kopf	963
Mouse adaptor	Stoelting	51625
Peristaltic pump for irrigation.	Cole-Parmer	WU-77120-42	Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.
Avitene Ultrafoam	Bard-Davol	1050020	Important to stop any minor bleeding instantly.
C&B Metabond	Parkell	S380	Much stronger than regular dental acrylic.
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)	Tocris	3525
Puralube opthalmic ointment	Dechra	17033-211-38
Mice	JAX	664
Prairie Ultima multiphoton microscope	Olympus
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)	UPENN Vector Core