In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico
Summary
Qui, presentiamo l’utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.
Abstract
Indotta da laser il neovascularization coroidico (CNV) è una modella ben affermata per imitare la forma umida di degenerazione maculare senile (AMD). In questo protocollo, ci proponiamo di guidare il lettore non semplicemente attraverso le considerazioni tecniche di generare lesioni indotte da laser per innescare processi neovascolare, ma piuttosto concentrarsi sulle informazioni potenti che possono essere ottenute da multimodal longitudinale in vivo imaging durante tutto il periodo di follow-up.
Il topo indotta da laser modello CNV è stato generato da un’amministrazione di laser del diodo. Tecniche di imaging multimodale in vivo sono stati utilizzati per monitorare la CNV induzione, progressione e regressione. Primo, tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) è stata effettuata immediatamente dopo la lavorazione laser per verificare una rottura della membrana di Bruch. Successivi in vivo imaging mediante angiografia della fluorescina (FA) ha confermato il successo danno della membrana di Bruch da seriale immagini acquisite a livello della coroide. Follow-up longitudinale di proliferazione di CNV e regressione nei giorni 5, 10 e 14 dopo la lavorazione laser è stato effettuato usando sia SD-OCT e FA. Semplice e affidabile di classificazione di leasions di CNV che perde da FA immagini è presentato. Segmentazione automatizzata per la misurazione dello spessore retinico totale, combinato con applicazione manuale calibro per la misurazione dello spessore retinico a siti CNV, consentire la valutazione imparziale della presenza dell’edema. Infine, verifica istologica di CNV viene eseguita utilizzando isolectin GS-IB4 colorazione sul flatmounts coroidico. La colorazione è con soglia, e viene calcolata l’area isolectin-positivi con ImageJ.
Questo protocollo è particolarmente utile negli studi di terapeutica che richiedono alta-velocità di trasmissione-come proiezione di patologia CNV quanto consente veloce, multimodale e affidabile classificazione dell’edema di patologia e retinico CNV. Inoltre, ad alta risoluzione SD-OCT consente la registrazione di altre caratteristiche patologiche, come l’accumulazione di liquido subretinal o intraretinico. Tuttavia, questo metodo non fornisce la possibilità di automatizzare l’analisi di volume CNV da immagini SD-OCT, che deve essere eseguita manualmente.
Introduction
Il primo tentativo riuscito di imitare la patologia di CNV umana nei roditori è stato dimostrato quasi tre decenni fa con un laser di krypton a lungo Evans ratti1. Da allora in poi, un laser di krypton è stato utilizzato per rompere la membrana di Bruch nel ceppo più popolare del mouse C57BL/6J2,3,4. Il tasso di successo dell’induzione di CNV è stato verificato con FA e macchie istologiche. Un rapido sviluppo di modalità di imaging non invasivo, ad esempio OCT, ha favorito la crescita del campo di modelli preclinici del roditore. La possibilità di monitorare i cambiamenti morfologici nella retina a più punti di tempo nello stesso occhio significativamente contribuisce alla riduzione dell’uso di animali e aumenta l’efficienza negli studi sperimentali. La valutazione istologica delle lesioni CNV è piuttosto semplice e richiede etichettatura di crescita vascolare anormale intorno al sito di amministrazione di laser, acquisizione di immagini e stima di superficie/volume utilizzando un software di analisi di immagine. Al contrario, la modalità di imaging in vivo introdurre più complesse analisi di CNV patologia e sua interpretazione.
Qui presentiamo un metodo semplice e relativamente veloce per induzione di grado, la progressione e regressione di CNV utilizzando FA, SD-OCT, e il metodo di segmentazione automatizzata nel topo indotta da laser CNV modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imaging multimodale offre preziosi strumenti per la valutazione di patologia CNV. Qui abbiamo presentato un protocollo imaging composto da FA, SD-OCT e segmentazione automatica per la valutazione rapida, riproducibile e affidabile di patologia CNV. Una rottura della membrana di Bruch dopo amministrazione del laser è stato confermato. Inoltre, l’uso di SD-OCT in questa fase anche ha permesso la visualizzazione immediata delle possibili emorragie intraretiniche e subretinal, che può confondere l’interpretazione dei risul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) e Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) per un eccellente supporto tecnico e videografiche. Programma di ricerca del Dr. Kaja è supportato dal Dr. John P. e Therese E. Mulcahy dotato Professorship in Oftalmologia presso la Loyola University di Chicago.
Materials
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedane) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
Riferimenti
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
