Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.
Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een veel gebruikte techniek voor het toewijzen van de lokalisatie van post-translationally gemodificeerde histonen, histone varianten, transcriptiefactoren of enzymen chromatine-aanpassen aan een bepaald locus of op een genoom-brede schaal. De combinatie van ChIP tests met volgende-generatie sequencing (dat wil zeggen, ChIP-Seq) is een krachtige aanpak van gene regulerende netwerken wereldwijd te ontdekken en ter verbetering van de functionele annotatie van genomen, met name van niet-coderende regulerende sequenties. ChIP protocollen kunnen doorgaans alleen grote hoeveelheden van celmateriaal, dus de uitschakeling van de toepasselijkheid van deze methode op het onderzoek naar zeldzame celtypes of kleine weefsel biopsieën. Om de ChIP bepaling verenigbaar is met de hoeveelheid biologisch materiaal dat doorgaans worden in vivo tijdens de vroege gewervelde embryogenese verkregen kan, beschrijven wij hier een vereenvoudigde ChIP protocol waarin het aantal stappen wilt uitvoeren, moet de assay werden gereduceerd monster verlies te minimaliseren. Dit protocol ChIP is met succes gebruikt om het onderzoeken van verschillende histone modificaties in verschillende embryonale kip en volwassen muis weefsels met behulp van lage aan middelgrote cel nummers (5 x 104 – 5 x 105 cellen). Nog belangrijker is, dit protocol is compatibel met ChIP-seq-technologie met behulp van de standaard bibliotheek bereidingswijzen, waardoor wereldwijde epigenomic kaarten in zeer relevant embryonale weefsels.
Histon posttranslationele modificaties zijn rechtstreeks betrokken bij diverse chromatine-afhankelijke processen, met inbegrip van transcriptie, replicatie en DNA repair1,2,3. Bovendien verschillende histone modificaties positieve Toon (b.v., H3K4me3 en H3K27ac) of negatief (bijvoorbeeld H3K9me3 en H3K27me3) correlaties met genexpressie en in grote lijnen gedefinieerd kunnen worden als activerende of repressieve Histon markeert, respectievelijk2,3. Bijgevolg, global Histon wijziging kaarten, ook wel aangeduid als epigenomic kaarten, opgedoken als krachtige en universele instrumenten functioneel aantekeningen gewervelde genoom4,5. Bijvoorbeeld, distale regulerende sequenties, zoals versterkers kunnen worden geïdentificeerd op basis van de aanwezigheid van specifieke chromatine handtekeningen (bijvoorbeeld actieve smaakversterkers: H3K4me1 en H3K27ac), die hen onderscheiden van proximale promotor regio’s (b.v., actieve promotoren: H3K4me3)6,7,8. Aan de andere kant, worden genen met grote cel identiteit regelgevende taken meestal gevonden met brede chromatine domeinen gemarkeerd met H3K4me3 of H3K27me3, afhankelijk van de transcriptionally actieve of inactieve status van de onderliggende genen, respectievelijk9 ,10. Ook lijkt de expressie van genen die grote cel identiteit te worden regelmatig gecontroleerd door meerdere en ruimtelijk geclusterd versterkers (dat wil zeggen, de Super-versterkers), die kunnen worden geïdentificeerd als brede H3K27ac-gemarkeerd domeinen11.
Momenteel, worden histone wijziging kaarten gegenereerd met behulp van de ChIP-seq-technologie, die in vergelijking met de vorige benaderingen zoals ChIP-chip (ChIP gekoppeld aan microarrays) hogere resolutie, minder artefacten, minder lawaai, meer dekking en lagere biedt kost12. Niettemin, de generatie van epigenomic kaarten met behulp van de ChIP-seq technologie heeft haar inherente beperkingen, meestal gekoppeld aan het vermogen om met succes uitvoeren ChIP in de monsters van belang. Traditionele ChIP protocollen vereist meestal miljoenen cellen, welk grensbedrag de toepasselijkheid van deze methode naar de cel in vitro lijnen of cellen die gemakkelijk geïsoleerd in vivo (bijvoorbeeld bloedcellen worden kan). In de afgelopen jaren zijn een aantal gemodificeerde ChIP protocollen compatibel met lage cel nummers beschreven13,14,15,16. Echter, deze protocollen zijn speciaal ontworpen om te worden gekoppeld met de volgende-generatie sequencing (dat wil zeggen, ChIP-seq), en zij gebruiken meestal ad hoc bibliotheek voorbereiding methoden13,14, 15 , 16.
Hier, we een ChIP protocol dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van Histon wijziging profielen met behulp van lage tot tussentijdse cel nummers (5 x 104 – 5 x 10,5 cellen) beschreven op beide geselecteerde loci (dat wil zeggen, ChIP-qPCR) of wereldwijd (dat wil zeggen, ChIP-seq) (Figuur 1). Wanneer gekoppeld aan ChIP-seq technologie, kan onze ChIP-protocol worden gebruikt samen met de standaard bibliotheek bereidingswijzen, waardoor het voor veel laboratoria10breed toegankelijk. Dit protocol is gebruikt voor het onderzoeken van verschillende Histon merken (bijvoorbeeld, H3K4me3, H3K27me3 en H3K27ac) in verschillende kip embryonale weefsels (bijvoorbeeld spinale neuraalbuis (SNT) uitsteeksels van de frontonasal en epiblast). Wij verwachten echter dat het breed toepasbare naar andere organismen in die biologisch en/of klinisch relevante monsters kunnen slechts worden verkregen in lage bedragen moet zijn.
Epigenomic profilering van Histon wijziging met behulp van de ChIP-seq kan worden gebruikt ter verbetering van de functionele aantekening van gewervelde genomen in verschillende contexten van de cellulaire4,5,18. Deze epigenomic-profielen kunnen worden gebruikt, onder andere om enhancer elementen, te definiëren van de regelgevende staat van versterkers (dat wil zeggen, actieve, primer, of klaar), en te bepalen van grot…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Jan Appel voor zijn uitstekende technische hulp tijdens de totstandbrenging van dit protocol. Werk in het laboratorium van de Rada-Iglesias wordt ondersteund door CMMC intramurale financiering, DFG onderzoekssubsidies (RA 2547/1-1 RA 2547/2-1 en TE 1007/3-1), de UoC geavanceerde onderzoeker groep Grant, en de toekenning van CECAD.
Reagent | |||
BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
SDS | Carl Roth | 1833 | |
Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
Glycine | |||
RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
Rotator | Stuart | SB3 | |
Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
Timer | Sigma | N/A | |
Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
Mixer | LMS | VTX 3000L | |
Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |