Qui, descriviamo un’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica ampiamente utilizzata per il mapping la localizzazione di istoni traduzionalmente modificati, varianti dell’istone, fattori di trascrizione o enzimi modificanti la cromatina a un dato locus o su una scala di genoma. La combinazione di analisi di ChIP con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-Seq) è un approccio potente per scoprire globalmente reti di regolazione genica e migliorare l’annotazione funzionale di genomi, soprattutto di non-codificazione di sequenze regolatrici. Protocolli di chIP normalmente richiedono grandi quantità di materiale cellulare, così precludendo l’applicabilità di questo metodo a investigare di tipi di cellule rare o le biopsie del tessuto piccolo. Al fine di rendere l’analisi del ChIP compatibile con la quantità di materiale biologico che in genere possa essere ottenuto in vivo durante l’embriogenesi dei vertebrati precoce, descriviamo qui un protocollo semplificato di ChIP in cui il numero di passaggi necessari per completare la analisi sono state ridotte per minimizzare la perdita di campione. Questo protocollo di ChIP è stato usato con successo per studiare le modificazioni istoniche differenti in vari pollo embrionale e tessuti di topo adulto utilizzando bassa ai numeri delle cellule medie (5 x 104 – 5 x 105 cellule). D’importanza, questo protocollo è compatibile con la tecnologia ChIP-seq utilizzando metodi di preparazione di libreria standard, fornendo così globale epigenomic mappe in tessuti embrionali altamente pertinenti.
Modificazioni post-traduzionali degli istoni sono direttamente coinvolti nei vari processi di cromatina-dipendenti, compreso trascrizione, replicazione e DNA riparazione1,2,3. Inoltre, modificazioni istoniche differenti mostrano positivi (ad es., H3K4me3 e H3K27ac) o negativo (ad es., H3K9me3 e H3K27me3) correlazioni con espressione genica e possono essere definiti largamente come attivante o repressivo dell’istone segna, rispettivamente di2,3. Di conseguenza, mappe di modifica globale dell’istone, noto anche come epigenomic mappe, sono emersi come strumenti potenti e universali per annotare funzionalmente i genomi di vertebrati4,5. Ad esempio, sequenze regolatrici distale come rinforzatori possono essere identificati in base la presenza di firme di cromatina specifici (ad es., esaltatori di attivo: H3K4me1 e H3K27ac), che li distinguono dalle regioni promotore prossimale (per esempio, promotori attivi: H3K4me3)6,7,8. D’altra parte, i geni con funzioni di regolamentazione di identità delle cellule principali si trovano tipicamente con domini di cromatina ampio contrassegnati con H3K4me3 o H3K27me3, a seconda dello stato trascrizionalmente attivo o inattivo dei geni sottostanti, rispettivamente9 ,10. Allo stesso modo, l’espressione di geni di identità delle cellule principali sembra essere controllato frequentemente dal multiplo e spazialmente cluster rinforzatori (cioè, Super-rinforzatori), che possono essere identificati come vasto H3K27ac-contrassegnato domini11.
Attualmente, istone modifica mappe vengono generate utilizzando la tecnologia ChIP-seq, che rispetto alle precedenti approcci come ChIP-chip (ChIP accoppiato ai microarray) fornisce maggiore risoluzione, meno artefatti, meno rumore, copertura superiore e inferiore Costa12. Tuttavia, la generazione di mappe di epigenomic utilizzando la tecnologia ChIP-seq ha i suoi limiti intrinseci, principalmente connesse con la capacità di eseguire correttamente il ChIP nei campioni di interesse. Protocolli di ChIP tradizionali in genere necessari milioni di cellule, che limitano l’applicabilità di questo metodo al cellulare in vitro linee o cellule che può essere facilmente isolato in vivo (ad esempio, cellule del sangue). Negli ultimi anni, un numero di protocolli di ChIP modificate compatibile con numeri di cellulare bassa è stati descritti13,14,15,16. Tuttavia, questi protocolli sono progettati specificamente per essere accoppiato con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-seq) e che in genere utilizzano hoc biblioteca preparazione metodi13,14, 15 , 16.
Qui, abbiamo descritto un protocollo di ChIP che può essere utilizzato per analizzare i profili di modifica dell’istone utilizzando numeri di basso a intermedio delle cellule (5 x 104 – 5 x 105 cellule) sia selezionato loci (cioè, ChIP-qPCR) o a livello globale (cioè, ChIP-seq) (Figura 1). Quando accoppiato alla tecnologia ChIP-seq, il nostro protocollo di ChIP può essere utilizzato insieme ai metodi di preparazione della libreria standard, rendendo così largamente accessibile a molti laboratori10. Questo protocollo è stato utilizzato per indagare parecchi contrassegni istone (ad es., H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) in tessuti embrionali di pollo diversi (ad es., tubo neurale spinale (SNT), frontonasale protuberanze ed epiblasto). Tuttavia, possiamo anticipare che dovrebbe essere ampiamente applicabile ad altri organismi in cui biologicamente e/o clinicamente rilevanti campioni possono essere ottenuti solo in basse quantità.
Epigenomic profilatura di modifica dell’istone utilizzando ChIP-seq può essere utilizzato per migliorare l’annotazione funzionale dei genomi di vertebrati in diversi contesti cellulari4,5,18. Questi profili di epigenomic possono essere utilizzati, tra le altre cose, per identificare gli elementi enhancer, per definire lo stato normativo di esaltatori di (cioè, attivo, innescato, o in bilico) e per definire regolatori …
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Jan Appel per la sua eccellente assistenza tecnica durante l’istituzione del presente protocollo. Lavoro in laboratorio Rada-Iglesias è supportato da CMMC intramurale finanziamenti, sovvenzioni di ricerca DFG (2547/1-1 RA, RA 2547/2-1 e TE 1007/3-1), il ricercatore avanzato UoC gruppo Grant e la concessione di CECAD.
Reagent | |||
BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
SDS | Carl Roth | 1833 | |
Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
Glycine | |||
RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
Rotator | Stuart | SB3 | |
Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
Timer | Sigma | N/A | |
Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
Mixer | LMS | VTX 3000L | |
Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |