Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.
Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma técnica amplamente utilizada para mapear a localização das histonas post-translationally modificadas, variantes de histona, fatores de transcrição ou enzimas de modificação de cromatina em um determinado locus ou na escala do genoma. A combinação de ensaios de ChIP com a próxima geração de sequenciamento (i.e., ChIP-Seq) é uma poderosa abordagem globalmente descobrir redes reguladoras do gene e melhorar a anotação funcional de genomas, especialmente de sequências reguladoras não-codificante. Microplaqueta protocolos normalmente requerem grandes quantidades de material celular, impedindo, assim, a aplicabilidade desse método para investigar os tipos de células raras ou biópsias de tecido pequeno. Para fazer o ensaio da microplaqueta compatível com a quantidade de material biológico que normalmente pode ser obtido na vivo durante a embriogênese precoce de vertebrados, descrevemos aqui um protocolo simplificado de ChIP em que o número de passos necessários para completar o ensaio foram reduzidos para minimizar a perda de amostra. Este protocolo de ChIP tem sido utilizado com sucesso para investigar as modificações do histone diferentes em vários galinha embrionária e tecidos de rato adulto usando baixa para números de telemóvel médio (5 x 104 – 5 x 105 células). Importante, este protocolo é compatível com a tecnologia de ChIP-seq usando métodos de preparação de biblioteca padrão, proporcionando assim global epigenomic mapas em tecidos embrionários altamente relevantes.
Borne-translational modificações do histone estão directamente envolvidas nos diversos processos dependentes de cromatina, incluindo a transcrição, replicação e reparo de ADN a1,2,3. Além disso, modificações do histone diferentes mostram positivas (por exemplo, H3K4me3 e H3K27ac) ou negativo (por exemplo, H3K9me3 e H3K27me3) correlações com a expressão de gene e pode ser amplamente definida como marca de histona ativando ou repressiva, respectivamente,2,3. Por conseguinte, mapas de modificação do histone global, também conhecidos como epigenomic mapas, têm emergido como ferramentas poderosas e universais para anotar funcionalmente genomas vertebrados4,5. Por exemplo, sequências reguladoras distais como potenciadores podem ser identificados baseiam na presença de assinaturas específicas da cromatina (por exemplo, potenciadores de ativo: H3K4me1 e H3K27ac), que distingui-las das regiões proximais promotor (por exemplo, ativos promotores: H3K4me3)6,7,8. Por outro lado, os genes com funções reguladoras de identidade de células grandes são encontrados tipicamente com domínios de cromatina amplo marcados com H3K4me3 ou H3K27me3, dependendo do estado transcricionalmente ativo ou inativo dos genes subjacentes, respectivamente9 ,10. Da mesma forma, a expressão de genes de identidade principal célula parece ser frequentemente controlado por múltiplo e espacialmente agrupado realçadores (ou seja, super potenciadores), que podem ser identificadas como grandes domínios H3K27ac-marcado11.
Atualmente, mapas de modificação de histonas são gerados usando a tecnologia de ChIP-seq, que, em comparação com abordagens anteriores como ChIP-chip (ChIP acoplado ao microarrays) fornece maior resolução, menos artefatos, menos ruído, maior cobertura e menor custa12. No entanto, a geração de mapas de epigenomic usando a tecnologia de ChIP-seq tem suas limitações inerentes, principalmente associadas com a capacidade de executar com êxito o ChIP nas amostras de interesse. Protocolos de ChIP tradicionais normalmente necessários milhões de células, que limite a aplicabilidade deste método de vitro em células, linhas ou células que pode ser facilmente isoladas na vivo (por exemplo, células do sangue). Nos últimos anos, um número de protocolos modificados de ChIP compatíveis com celulares de baixo foram descritos13,14,15,16. No entanto, esses protocolos são projetados especificamente para ser acoplado a próxima geração sequenciamento (i.e., ChIP-seq), e eles geralmente usam ad-hoc biblioteca preparação métodos13,14, 15 , 16.
Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP que pode ser usado para investigar perfis de modificações do histone usando números de telemóvel baixas a intermédias (5 x 104 – 5 x 105 células) em qualquer loci selecionado (ou seja, ChIP-qPCR) ou globalmente (ou seja, ChIP-seq) (Figura 1). Quando acoplado à tecnologia ChIP-seq, nosso protocolo de ChIP pode ser usado em conjunto com os métodos de preparação de biblioteca padrão, tornando-se amplamente acessível para muitos laboratórios10. Este protocolo tem sido usado para investigar várias marcas de histona (por exemplo, H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) em tecidos embrionários de frango diferente (por exemplo, na coluna tubo neural (SNT), proeminências frontonasal e epiblasto). No entanto, nós antecipamos que deve ser amplamente aplicável para outros organismos em que amostras biologicamente e/ou clinicamente relevantes podem ser obtidas apenas em pequenas quantidades.
Epigenomic caracterização das modificações do histone usando ChIP-seq pode ser usado para melhorar a anotação funcional de genomas de vertebrados em diferentes contextos celular4,5,18. Estes perfis de epigenomic podem ser usados, entre outras coisas, para identificar elementos potenciador, para definir o estado regulador de realçadores (i.e., ativo, preparado, ou preparada) e definir reguladores de célula grande…
The authors have nothing to disclose.
Os autores Agradecemos sua excelente assistência técnica durante o estabelecimento deste protocolo Jan Appel. Trabalho no laboratório Rada-Iglesias é suportado pelo CMMC intramural financiamento, bolsas de investigação DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 e TE 1007/3-1), o pesquisador avançado UoC grupo Grant e o CECAD Grant.
Reagent | |||
BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
SDS | Carl Roth | 1833 | |
Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
Glycine | |||
RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
Rotator | Stuart | SB3 | |
Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
Timer | Sigma | N/A | |
Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
Mixer | LMS | VTX 3000L | |
Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |