Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Rizwan Rehimi; Michaela Bartusel; Francesca Solinas; Janine Altmüller; Alvaro Rada-Iglesias

doi:10.3791/56186

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Articolo metodologico

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

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DOI:

10.3791/56186

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29 agosto 2017

Rizwan Rehimi¹ , Michaela Bartusel¹ , Francesca Solinas² , Janine Altmüller² , Alvaro Rada-Iglesias¹^,³

¹Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), University of Cologne, ²Cologne Center for Genomics (CCG), University of Cologne, ³Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Research Center and Systems Biology of Ageing Cologne, University of Cologne

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

Abstract

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica ampiamente utilizzata per il mapping la localizzazione di istoni traduzionalmente modificati, varianti dell'istone, fattori di trascrizione o enzimi modificanti la cromatina a un dato locus o su una scala di genoma. La combinazione di analisi di ChIP con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-Seq) è un approccio potente per scoprire globalmente reti di regolazione genica e migliorare l'annotazione funzionale di genomi, soprattutto di non-codificazione di sequenze regolatrici. Protocolli di chIP normalmente richiedono grandi quantità di materiale cellulare, così precludendo l'applicabilità di questo metodo a investigare di tipi di cellule rare o le biopsie del tessuto piccolo. Al fine di rendere l'analisi del ChIP compatibile con la quantità di materiale biologico che in genere possa essere ottenuto in vivo durante l'embriogenesi dei vertebrati precoce, descriviamo qui un protocollo semplificato di ChIP in cui il numero di passaggi necessari per completare la analisi sono state ridotte per minimizzare la perdita di campione. Questo protocollo di ChIP è stato usato con successo per studiare le modificazioni istoniche differenti in vari pollo embrionale e tessuti di topo adulto utilizzando bassa ai numeri delle cellule medie (5 x 10⁴- 5 x 10⁵ cellule). D'importanza, questo protocollo è compatibile con la tecnologia ChIP-seq utilizzando metodi di preparazione di libreria standard, fornendo così globale epigenomic mappe in tessuti embrionali altamente pertinenti.

Introduzione

Modificazioni post-traduzionali degli istoni sono direttamente coinvolti nei vari processi di cromatina-dipendenti, compreso trascrizione, replicazione e DNA riparazione¹^,²^,³. Inoltre, modificazioni istoniche differenti mostrano positivi (ad es., H3K4me3 e H3K27ac) o negativo (ad es., H3K9me3 e H3K27me3) correlazioni con espressione genica e possono essere definiti largamente come attivante o repressivo dell'istone segna, rispettivamente di²^,³. Di conseguenza, mappe di modifica globale dell'istone, n....