Forberedelse af prøver og analyser af RNASeq-baseret genekspression Data fra zebrafisk
Summary
Denne protokol præsenterer en tilgang til hele transkriptom analyse fra zebrafisk embryoner, larver, eller sorteret celler. Vi omfatter isolering af RNA, sti analyse af RNASeq data og qRT-PCR-baserede validering af gen expression ændringer.
Abstract
Analyse af globale gen expression ændringer er et værdifuldt redskab til at identificere nye veje underliggende observerede fænotyper. For zebrafisk er en fremragende model for hurtig vurdering af hele transkriptom fra hele dyr eller individuelle cellepopulationer på grund af lethed af isolering af RNA fra et stort antal dyr. Her præsenteres en protokol for globale gen expression analyse i zebrafisk embryoner ved hjælp af RNA sekventering (RNASeq). Vi beskriver forberedelse af RNA fra hele embryoner eller cellepopulationer fremstillet ved hjælp af cellen sortering i transgene dyr. Vi beskriver også en tilgang til analyse af RNASeq data til at identificere beriget veje og gen ontologi (gå) vilkår i globale gen expression datasæt. Endelig, vi leverer en protokol for validering af gen expression ændringer ved hjælp af kvantitative reverse transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokoller kan bruges til komparative analyser af kontrol og eksperimentelle sæt af zebrafisk for at identificere nye gen expression ændringer og give molekylære indsigt fænotyper af interesse.
Introduction
Sammenlignende analyse af globale genekspression er et værdifuldt redskab til at identificere nye gener bidrager til observerede fænotyper. Sådanne analyser typisk stole på kvantitativ vurdering af udskrift overflod i forhold mellem eksperimentelle og kontrolprøver. Målrettede tiltag, såsom qRT-PCR er forholdsvis hurtig og nøjagtig undersøgelse af enkelt gen expression ændringer. RNA sekventering (RNASeq) tilbyder en bred, hypotese-fri tilgang for at identificere væsentlige ændringer i genekspression mellem prøver, gør det nu standard for sådanne undersøgelser på tværs af eksperimentelle systemer.
Zebrafisk er dukket op som en fremtrædende model på tværs af mange sygdomsområder. Oprindeligt udviklet til deres nytte i undersøgelser, udviklingsmæssige biologi, på grund af deres høje frugtbarhed og relativt lave udgifter til vedligeholdelse, eksperimenterende brug af zebrafisk har udviklet sig til også for at omfatte en bred vifte af fænotyper fra embryonale voksen faser såvel som en bred vifte af molekylære undersøgelser,1,2,3. Ja, disse fordele gør molekylære Mekanistiske undersøgelser hurtige og omkostningseffektive på grund af lethed, hvormed erhverve store mængder af materiale kombineret med lethed af både genetiske og miljømæssige manipulation på alle stadier af livet. Desuden zebrafisk embryoner og larver gennemsigtige karakter gør den ideel til generering af celle – og tissue-specifikke transgene reporter linjer giver i vivo visualisering af diskrete celle populationer4. Udnyttelse af sådanne linjer tillader global gen expression analyse i særlige isolerede celletyper baseret på reporter gen expression.
Her præsenterer vi en omfattende protokol for globale gen expression analyse ved hjælp af RNASeq efter kultur af zebrafisk embryoner. Genetiske eksperimentelle manipulationer, herunder morpholino (MO)-baseret forbigående gen knockdown eller CRISPR-medieret genom-redigering, er blevet præsenteret andetsteds5,6,7. Vi har derfor fokusere på en detaljeret protokol til isolering af RNA fra hele embryoner eller sorteret transgene reporter-udtrykker celler efterfulgt af simple beregningsmæssige analyse af RNASeq resultater ved hjælp af pathway værktøjer og gen ontologi (GO) vilkår. Endelig har vi medtaget en strategi for validering af gen expression ændringer af kvantitative reverse transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokoller er gældende for zebrafisk embryoner udsat for en lang række eksperimentelle betingelser, herunder sammenligning af genetiske mutanter eller miljømæssige forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåden i denne protokol tilbyder en relativt hurtige og omkostningseffektive strategi for transkriptom-niveau analyse af hele dyr eller bestemte sorterede cellepopulationer. For zebrafisk giver en fordelagtig model for denne type af undersøgelse på grund af den lethed og hurtighed i at generere store mængder materiale, lethed i gennemførelsen af genetiske eller miljømæssige forsøgsbetingelser og tilgængeligheden af en stor spektrum af transgene reporter linjer giver mulighed for dyrkning af celletype spe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) og T32DK098107 (T.L.H. og J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
Riferimenti
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
