Протокол твердофазного синтеза олигомеров РНК, содержащий 2'-<em> O</em> -тиофенилметильная модификация и характеризация с помощью циркулярного дихроизма
Summary
В этой статье представлена подробная процедура твердофазного синтеза, очистки и характеризации додекамеров РНК, модифицированных при C2'- O -позиции. Фотометрический анализ методом ультрафиолетового и кругового дихроизма используется для количественной оценки и характеристики структурных аспектов, то есть одножильных или двухжильных.
Abstract
Твердофазный синтез был использован для получения канонических и модифицированных полимеров нуклеиновых кислот, в частности ДНК или РНК, что сделало его популярной методологией для применений в различных областях и для различных исследовательских целей. Описанная здесь процедура фокусируется на синтезе, очистке и характеристике додекамеров РНК 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3', содержащих нулевую, одну или две модификации, расположенные на C2'- O -позиции. Зонды основаны на 2-тиофенилметильных группах, включенных в РНК-нуклеотиды посредством стандартного органического синтеза и вводимых в соответствующие олигонуклеотиды через их соответствующие фосфорамидиты. В этом отчете используется химия фосфорамидита через четыре канонические нуклеотиды (Uridine (U), Cytosine (C), гуанозин (G), аденозин (A)), а также 2-тиофенилметилфункциональные нуклеотиды, модифицированные на 2'- O- должность; Однако, эта методология применима к большому varКоторые были разработаны на протяжении многих лет. Олигонуклеотиды синтезировали на носителе с контролируемым поровым стеклом (CPG) с последующим отщеплением из смолы и снятием защиты в стандартных условиях, то есть смесью аммиака и метиламина (АМА) с последующим фторидом водорода / триэтиламином / N-метилпирролидиноном. Соответствующие олигонуклеотиды очищали с помощью полиакриламидного электрофореза (20% денатурации) с последующим элюированием, обессоливанием и выделением с помощью хроматографии с обращенной фазой (Sep-pak, C 18- column). Количественную оценку и структурные параметры оценивали с помощью ультрафиолетового (UV-vis) и кругового дихроизма (CD) фотометрического анализа, соответственно. Этот доклад призван служить в качестве ресурса и руководства для начинающих и экспертов-исследователей, заинтересованных в походах в эту область. Ожидается, что он будет работать в процессе разработки, поскольку будут разработаны новые технологии и методологии. Описание методологий и методов вS соответствует синтезу ДНК / РНК (восстановленному и приобретенному в 2013 году), который использует химию фосфорамидита.
Introduction
Твердофазный синтез для получения олигонуклеотидов ДНК / РНК является мощным инструментом, который обслуживал несколько приложений в различных областях с 1970-х годов 1 , 2 , 3 с использованием блоков 4 фосфорамидита. Примеры его широкого влияние включают в себя: его воздействие в маркировке ( с помощью химии нажмите реакции) 5, структурного зондирующее 6 и антисмысловые технологии 7, а также его выяснение биологических механизмов 8, 9, источника в качестве генетического материала 10, и изучение Различные природные и / или химические модификации 11 , 12 , среди многих других. Модификация, которую мы здесь используем, представляет собой первый шаг в наших усилиях по получению олигонуклеотидов РНК, которые содержатФотоактивные зонды для обеспечения временного контроля структуры и функции этого важного биополимера.
Синтез додекамеров РНК с последовательностями: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3' (подчеркнутые положения представляют собой включение C2'- O- тиофенилметильной модификации ) Составляет основное внимание в этом исследовании. Последовательности были выбраны так, чтобы обеспечить количественную оценку и измерение нитей РНК как одиночных цепей или их соответствующих дуплексных структур (никакие другие вторичные структуры не были предсказаны как термодинамически стабильные). CD был использован для установления структурных параметров, т. Е. Дуплексного образования и термических денатурационных переходов.
Синтез
Общая процедура получения этих олигонуклеотидов проиллюстрирована на рисунке 1 и следует поэтапному процессу: автоматизированный твердофазный синтез → DeprOtection → Очистка → Количественная оценка → Характеристика. На рисунке 2 показаны мономерные единицы, которые необходимы в этой процедуре. Твердофазный синтез РНК аналогичен твердофазному синтезу ДНК, поскольку он основан на химии фосфорамидитов ( рис. 2 , слева) и использовании базово-лабильных защитных групп для нуклеофильных экзоциклических аминов на G, A и C, например , Ацетил, бензоил, феноксиацетил, трет- бутил или N , N- диметилформамид ( фиг. 2 , справа). Еще один аспект, который следует учитывать в РНК из-за присутствия C2'-OH-группы (отсутствующей в дезоксиолигонуклеотидных биополимерах), является дополнительной стадией, которая должна быть включена для защиты и последующего снятия защиты с этой нуклеофильной позиции. В этом отношении защитные группы на основе кремния стали привлекательной стратегией из-за их потенциала как биортогональных фрагментов (specificallY сняли защиту в присутствии фторида), так как группы трет- бутилдиметилсилил (TBDMS) и триизопропилсилилоксиметил (TOM) являются популярными ( рис. 2 , внизу слева).
В этой работе автоматизированный синтез проводили на синтезаторе ДНК / РНК, который использует стандартную химию фосфорамидита. Настройки изготовителя на инструменте включают автоматическую стадию разбавления при использовании коммерческих версий фосфорамидитов для ДНК или возможность разбавления в объемах, заданных пользователем. Однако мы решили взвешивать РНК фосфорамидит и разбавлять вручную, учитывая, что: 1) цена канонических фосфорамидитов РНК выше (в некоторых случаях в 50 раз дороже); 2) модифицированные фосфорамидиты часто получают в небольших количествах; И 3) количество затраченного материала при использовании этапа автоматизированного разбавления (устанавливается изготовителем) является большим. Кроме того, мы использовали: 1) коммерчески доступные твердые опоры( Например , CPG), содержащую защищенную нуклеотидную основу, чтобы функционировать как 3'-конец; И 2) коммерческие фосфорамидиты (канонические нуклеотидные основания), защищенные группой TBDMS при C2'- O -позиции. Подробный перечень этапов синтеза представлен на рис. 3 и в таблице 1 вместе с дальнейшим описанием и комментариями для шагов, которые были скорректированы для синтеза РНК. Кроме того, на рисунке 4 показаны ступенчатые выходы, которые наблюдаются для каждого шага после выбора опции «Trityl Monitor», которая количественно оценивает тритильный катион, высвобождаемый с каждого этапа дебитиляции.
Стоит отметить, что, как нам показалось, лимитирующим фактором является получение фосфорамидита, содержащего требуемую модификацию. То есть, разработка синтетической методологии, которая позволяет вносить изменения в отдельные сайты. В этом отчете мы сосредоточим внимание наВведение модифицированного нуклеотида, для которого была установлена соответствующая синтетическая методика, C2'- O- тиофенилметильная группа. Эта группа мала по размеру и никоим образом не влияет на твердофазный синтез. Поскольку сообщалось о включении этой группы в олигонуклеотиды РНК, наряду со структурными и термодинамическими параметрами 4 , здесь не будут описаны аспекты органического синтеза, приводящего к модифицированным фосфорамидитам.
Снятие защиты, очистка и характеристика
Снятие защиты с экзоциклических аминов и ß-цианоэтильных групп происходит на той же стадии, что и расщепление от CPG-смолы. Мы применили общеупотребительные условия нагревания полученной смолы в присутствии водного раствора АМА с последующим расщеплением C2'- O- силильных групп в присутствии ионов фторида и затем очисткой через гельэлектрофорез. Хотя во многих случаях они стали стандартными условиями, модификации, которые являются лабильными для основных условий или ионов фторида, могут потребовать более мягкие условия 13 , 14 , например , карбонат метанола / калия (MeOH / K 2 CO 3 ) или бутиламин. Таким образом, необходим другой набор защитных групп на соответствующих фосфорамидитах. Кроме того, мы выбрали электрофорез в качестве предпочтительной альтернативы очистке снятых защитных олигомеров, учитывая наш предыдущий опыт этого метода и отсутствие других инструментов. Однако ВЭЖХ можно альтернативно использовать в качестве эффективного метода 15 . Характеристика очищенных олигонуклеотидов проводилась с помощью масс-спектрометрии, лазерной десорбции / ионизации-времени полета (МАЛДИ-ТОФ) с матричной поддержкой, с использованием описанной процедуры нашей группой 16 .
Структурная характеристика и Устойчивость полученных дуплексов была выполнена с помощью CD. В частности, мы используем CD для определения температурных денатурационных переходов модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов РНК, следуя уменьшению эллиптичности полосы прибл. 270 нм, а также исчезновение полосы (с отрицательной эллиптичностью) с λ max при 210 нм. Сравнение спектров до и после гибридизации предоставляется для иллюстрации их различий и обеспечения валидации применяемой методологии. Использование CD широко принимается при определении структурных мотивов в нуклеиновых кислотах и аминокислотах 17 и поэтому может быть использовано в качестве инструмента для определения различных структурных и термодинамических параметров 18 ; Однако, существует мало примеров, где метод используется для оценки тепловых денатурационных переходов. Некоторые случаи включают определение термической стабильности на ДНК, содержащей G-квадруплексыAss = "xref"> 19 , 20 или в дуплексах и шпильках РНК 21 .
Этот отчет предназначен для предоставления читателю или зрителю, не являющемуся экспертом, набором инструментов, которые позволят обеспечить плавный запуск этого типа исследований. Он будет способствовать усилению и сопоставлению с методологиями и методами в других исследовательских лабораториях, которые участвуют в этой увлекательной отрасли науки. Содержание в этом отчете добавляет к существующим протоколам этой технологии из разных источников и обогащает и облегчает опыт визуальной помощи для каждого шага.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель этой рукописи – служить руководством для исследователей в области, начинающих или экспертов, для успешного достижения или усиления синтеза олигонуклеотидов ДНК или РНК. Описанная методика фокусируется на использовании твердофазного синтеза с использованием автоматизированног?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Подготовка этой рукописи была поддержана через пусковые фонды из Университета Колорадо Денвер (JMRE). AF хотела бы подтвердить поддержку от конкурса исследований и творческих действий (RaCAS, CU Denver). Признается финансирование со стороны Управления исследовательских служб Университета Колорадо Денвер для покрытия расходов на публикацию. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории г-жу Кассандру Герберт и г-на Янника К. Дзово за их вклад в видеоролик.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2′-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified ‘ultra-mild’ DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2′-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA – a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses – A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2′-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -. L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. . RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).
