2 '末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール<em> O</em>チオフェンメチル修飾と環状二色性によるキャラクタリゼーション
Summary
この記事では、C2'- O-位置で修飾されたRNAのドデカマーの固相合成、精製、およびキャラクタリゼーションに関する詳細な手順を提供します。 UV-visおよび円二色性光度分析を用いて、構造的側面、 すなわち一本鎖または二本鎖を定量化および特徴づける。
Abstract
固相合成は、様々な分野および異なる研究目的での応用のための一般的な方法論にしてきた核酸、特にDNAまたはRNAのカノニカルおよび修飾ポリマーを得るために使用されてきた。本明細書に記載の手順は、C2 ' O位に位置する0個、1個または2個の修飾を含むRNA5' – [CUA CGG AAU CAU] -3 'のドデカマーの合成、精製および特徴づけに焦点を当てている。プローブは、2-チオフェニルメチル基に基づいており、標準的な有機合成によってRNAヌクレオチドに組み込まれ、それぞれのホスホルアミダイトを介して対応するオリゴヌクレオチドに導入される。この報告では、2'- O-メチルアミノ基で修飾された2-チオフェニルメチル官能基化ヌクレオチドと同様に、4つの標準核酸塩基（Uridine（U）、Cytosine（C）、Guanosine（G）、Adenosine（A））を介したホスホラミダイト化学、ポジション;しかし、この方法論は大きなvar何年にもわたって開発されてきた変更の数々。オリゴヌクレオチドは、制御された孔のガラス（CPG）支持体上で合成され、続いて樹脂から切断され、標準的な条件、 すなわちアンモニアとメチルアミン（AMA）、続いてフッ化水素/トリエチルアミン/ N-メチルピロリジノンの混合物の下で脱保護された。対応するオリゴヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィー（9-PAK、C 18 -カラム）を介して溶出、脱塩、及び単離に続いて、ポリアクリルアミド電気泳動（20％変性）を介して精製しました。 UV可視（UV-vis）および円二色性（CD）光度分析により、定量化および構造パラメータを評価した。このレポートは、この分野に着手するのに興味がある初心者や専門家のためのリソースとガイドとして役立つことを目指しています。新しい技術と方法論が開発されるにつれて、それは進行中の仕事として役立つことが期待されています。 thi内の方法論とテクニックの記述ホスホラミダイト化学を使用するDNA / RNA合成装置（2013年に改装され購入された）に対応しています。
Introduction
DNA / RNAのオリゴヌクレオチドを得るために、固相合成は、ホスホルアミダイトビルディングブロック4を使用して、1970年代1は、様々な分野でいくつかのアプリケーションを配信している強力なツールである2,3。その広範な影響の例としては、その6をプローブ構造（クリック化学反応を介して ）標識の衝撃5、、およびアンチセンス技術7、ならびに遺伝物質10のような生物学的機構8、9、ソースのその解明、および研究を我々はここで使用する多くothers.The修飾のうち種々の天然および/または化学修飾11、12、含有RNAオリゴヌクレオチドを得るための努力の最初のステップを表しますこの重要な生体高分子の構造および機能の時間的制御を可能にする光活性プローブ。
5 ' – [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 ' – [AUG AUU CCG UAG] -3'（下線部はC2'- O-チオフェニルメチル修飾の取り込みを表す）を用いたRNAドデカマーの合成）が本研究の焦点となる。この配列は、RNA鎖の単鎖またはその対応する二本鎖構造（他の二次構造は熱力学的に安定であるとは予測されなかった）として定量化および測定できるように選択した。 CDを使用して、構造パラメーター、 すなわち二本鎖形成および熱変性転移を確立した。
合成
これらのオリゴヌクレオチドを得るための全体的な手順を図1に示し、段階的方法に従う：自動化された固相合成→Depr検出→定量→定量→特徴付け。 図2は、この手順で必要な単量体単位を示す 。それはホスホラミダイト化学（ 図2、左）およびG、A及びC上の求核性環外アミン、 例えばための塩基に不安定な保護基の使用に基づいているという点で、RNAの固相合成は、DNAの場合と同様ですアセチル、ベンゾイル、フェノキシアセチル、 t-ブチルまたはN 、 N-ジメチルホルムアミド（ 図2 、右）。 C2'-OH基（デオキシオリゴヌクレオチドバイオポリマーに欠けている）の存在に起因してRNAにおいて考慮すべきもう一つの側面は、この求核位置の保護および引き続く脱保護のために取り込まなければならない追加の工程である。この点で、ケイ素系保護基は、それらが双直交部分としての可能性のために魅力的な戦略になっている（特定tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）およびトリイソプロピルシリルオキシメチル（TOM）基を一般的な選択肢（ 図2 、左下）として使用して、フッ素の存在下で脱保護する。
この研究では、標準的なホスホルアミダイト化学を用いるDNA / RNA合成装置で自動合成を行った。装置の製造者の設定には、DNA用のホスホラミダイトの市販バージョンを使用する場合の自動希釈ステップ、またはユーザーが設定した容量で希釈するオプションが含まれる。しかし、我々は、RNAホスホラミダイトの重量を量り、手動で希釈することを決めた。すなわち、1）RNAのカノニカルホスホラミダイトの価格がより高い（場合によっては50倍も高価である）。 2）修飾ホスホラミダイトはしばしば少量で得られる。 3）自動化された希釈ステップ（製造業者によって設定）を使用する際の無駄な物質の量が多い。さらに、我々は、1）市販の固体支持体3 '末端として機能するように保護された核酸塩基を含む核酸分子（ 例えば 、CPG） 2）C2'- O-位置でTBDMS基で保護された市販のホスホラミダイト（カノニカル核酸塩基）。合成工程の詳細なリストは、RNA合成のために調整された工程に関するさらなる説明およびコメントとともに、 図3および表1に示されている。さらに、 図4は、各脱トリチル化工程から放出されたトリチルカチオンを定量する「トリチルモニター」オプションを選択した後の各ステップについて観察された段階的収率を示す。
典型的には、我々の経験では、制限因子は所望の修飾を含むホスホラミダイトを得ることであったことは注目に値する。すなわち、選択された部位に修飾の取り込みを可能にする合成方法の開発である。このレポートでは、対応する合成方法論であるC2'- O-チオフェニルメチル基を確立した修飾ヌクレオチドの組み込み。この群は、サイズが小さく、固相合成に何ら影響を与えない。この群のRNAのオリゴヌクレオチドへの取り込みが構造的および熱力学的パラメーター4と共に報告されているので、修飾されたホスホラミダイトをもたらす有機合成の態様は本明細書に記載されない。
脱保護、精製およびキャラクタリゼーション
環外アミンおよびβ-シアノエチル基の脱保護は、CPG樹脂からの切断と同じ工程で起こる。得られた樹脂をAMAの水溶液の存在下で加熱し、フッ化物イオンの存在下でC2'- O-シリル基を開裂させ、次いでゲルを介して精製するという一般的な条件を適用した電気泳動。これらは、多くの場合、標準的な条件、より穏やかな条件13、14、 例えば 、メタノール/炭酸カリウム（メタノール/ K 2 CO 3）、又はブチルアミンを必要とすることが基本条件またはフッ化物イオンに不安定な変更になってきています。したがって、対応するホスホラミダイト上の異なるセットの保護基が必要である。さらに、本発明者らは、この方法の以前の経験および他の機器の欠如を考慮して、脱保護されたオリゴマーを精製するための好ましい代替物として電気泳動を選択した。しかし、代わりにHPLCを有効な方法として使用することも可能である15 。精製されたオリゴヌクレオチドの特徴付けは、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化 – 飛行時間（MALDI-TOF）を介して、我々のグループ16による報告された手順を用いて行った。
構造的特徴付けとその得られた二重鎖の安定性はCD を介して行った。具体的には、CDを用いて、修飾されたRNAおよび修飾されていないRNAの熱変性転移を、バンドの楕円率の低下をca. （負の楕円率を有する）バンドの消失とともに、210nmでのλmaxでの消光を示す。ハイブリダイゼーションの前後のスペクトル比較は、それらの違いを説明し、使用された方法論のバリデーションを提供するために提供される。 CDの使用は、核酸およびアミノ酸17の構造モチーフの決定において広く受け入れられており、したがって、様々な構造および熱力学的パラメーターを決定するためのツールとして使用することができる18 。しかしながら、この技術を熱変性の変化を評価するために用いる多くの例はない。いくつかの場合には、G-quadruplexesを含むDNAに対する熱安定性の決定が含まれる尻=「外部参照」> 19、20、または二本鎖RNAと21のヘアピンです。
このレポートは、非専門家の読者または視聴者に、この種の研究を円滑に開始するための一連のツールを提供する予定です。このエキサイティングな科学分野に関わる他の研究機関の方法論や技術を強化し、比較するのに役立ちます。このレポートの内容は、さまざまな情報源からこのテクノロジーの既存のプロトコルを追加し、各ステップの視覚的な援助の経験を豊かにし、容易にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿の目的は、DNAまたはRNAのオリゴヌクレオチドの合成を首尾よく達成または促進するための、初心者または専門家の分野の研究者へのガイドとして役立つことである。記載された方法論は、標準的なホスホロアミダイト化学を介した自動DNA / RNA合成装置を用いた固相合成の使用に焦点を当てている。この報告書は、RNAドデカマーの合成、精製、および特徴付けの段階的描写について記?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿の作成は、コロラド大学デンバー大学（JMRE）からのスタートアップファンドによってサポートされました。 AFはResearch and Creative Activities賞（RaCAS、CU Denver）の支援を受けたいと考えています。コロラド大学デンバー校の研究サービスオフィスからの報奨金は、出版費用をカバーすると認められています。私たちはビデオ部分での貢献について、Cassandra HerbertさんとYannick K. Dzowoさんに感謝したいと思います。
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
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