マウス網膜細動脈Ex Vivoでの反応性の測定の準備手順
Summary
多くのビジョンを脅かす眼疾患は、網膜血管の機能不全に関連付けられます。したがって、網膜血管応答の測定は、根本的な病態生理学的メカニズムを調査することが重要です。この記事では、マウスの網膜細動脈の分離と血管作動性物質の血管径に及ぼす影響を評価するために準備のための詳しいプロトコルについて説明します。
Abstract
血管不全と通常の網膜血流の変化、様々 な視力を脅かす眼疾患、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症と緑内障などの発症の主な要因です。したがって、網膜微小血管の準備、基本的な病態生理学的メカニズムを記述する生理学的および薬理学的研究とデザイン疾患の治療に極めて重要なツールです。眼科研究マウス モデルの普及にもかかわらず網膜血管反応性に関する研究がこの種の不足しています。この矛盾の主な理由はであるこれらの網膜血管のサイズが小さいため挑戦的な分離のプロシージャ 〜 ≤ 内腔の直径 30 μ m。前のヴィヴォ近く生理条件下でマウス網膜血管反応の研究をできる分離および準備の技術を設けてこれらの網膜微小血管の機能研究のための直接分離の問題を回避するために.現在実験準備は特にマウス網膜細動脈を参照、ただしこの方法容易にラットから微小血管を利用します。
Introduction
網膜の血流障害は、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症、緑内障1,2,3などの様々 な眼疾患の病態に関与しています。したがって、網膜の血管反応性の測定を目的とした研究がこれらの疾患の病態を理解することが重要、新しい治療法を開発するために近づきます。
マウスのゲノムに遺伝子操作の可能性があるためマウス心血管系4研究の広く使用されている動物モデルとなっています。しかし、網膜血管 (≤ 30 μ m) のサイズが小さいためマウス網膜における血管反応性の測定は難しい。たとえば、生体内計測表面技術の光学解像度で限られている、まさに搭載時 ≤ 30 μ m 径未満の少量の血液で直径または血の流れの変化を検出することがのみできます。蛍光染料または適応光学スキャン ・光検眼鏡5,6を使用して共焦点顕微鏡など、追加の高度なデバイスまた、ローカルの識別を目的とした体内測定の解釈は網膜血管のメカニズムは、麻酔薬、によって混同することができますシグナリング全身血圧と球後血管の影響で変更します。
したがって前のヴィヴォ高光学解像度とマウスの網膜の血管の反応を測定する方法を開発しました。ここに記載した技術光顕微鏡を介して送信される網膜細動脈の描出が可能します。ラットにも使用することができます、この方法は、眼血管研究の技術をターゲット遺伝子の利点へのアクセスを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウス網膜における血管反応の測定は、網膜血管のサイズが小さいため困難です。紹介したテクニックを持つ網膜細動脈は透過光顕微鏡による可視化します。これは、孤立した網膜は半透明なので可能です。テクニックの利点は、高光学解像度です。計算された空間分解能は 11 px/μ m です。ただし、白色光を使用する光学系の実際の解像度は 200 と 300 nm、アッベの回折限界で説明されている?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、エルンスト ・ ウント ベルタ Grimmke 財団とドイツの Ophthalmologische 協会 (犬) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
