Forberedelsene for måling av reaktivitet i musen Retinal arterioler Ex Vivo
Summary
Mange visjon-truende øyet sykdommer er assosiert med dysfunksjonelle retinal microvessels. Måling av netthinnen arteriole svar er derfor viktig å undersøke de underliggende patofysiologiske mekanismene. Denne artikkelen beskriver en detaljert protokoll for musen retinal arteriole isolasjon og forberedelser for å vurdere effekten av vasoactive stoffer på vaskulær diameter.
Abstract
Vaskulær insuffisiens og endringer i normal retinal perfusjon er blant de viktigste faktorene for patogenesen av ulike sight-truende øyet sykdommer, som diabetisk retinopati, Hypertensiv retinopati og muligens glaukom. Netthinnen mikrovaskulær forberedelser er derfor avgjørende verktøy for fysiologiske og farmakologiske studier for å avgrense de underliggende patofysiologiske mekanismene og design terapi for sykdommer. Til tross for den vide bruken av musen modeller i ophthalmica forskning er studier på netthinnen vaskulær reaktivitet mangelvare i denne arten. En viktig grunn til dette avviket er de utfordrende isolering prosedyrene på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar, som er ~ ≤ 30 µm luminal diameter. For å omgå problemet med direkte isolering av disse retinal microvessels for funksjonell studier, etablert vi en isolasjon og forberedelse teknikk som gjør at ex vivo studier av musen retinal vasoactivity under nær fysiologiske forhold . Selv om dagens eksperimentelle forberedelsene spesielt gjelder mus retinal arterioler, kan denne metodikken lett anvendes til microvessels fra rotter.
Introduction
Forstyrrelser i netthinnen perfusjon har vært innblandet i patogenesen av ulike øyet sykdommer, som diabetisk retinopati, Hypertensiv retinopati og glaukom1,2,3. Dermed studier måle vaskulær reaktivitet i netthinnen er viktig å forstå i Patofysiologien ved disse sykdommene, og for å utvikle ny behandling tilnærminger.
På grunn av muligheten for genet manipulasjon i murine genomet, har musen blitt en utbredt dyr modell for studier av kardiovaskulære systemet4. Men på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar (≤ 30 µm) er måling av vaskulær reaktivitet i musen netthinnen utfordrende. For eksempel stereomicroscopic teknikker for måling i vivo er begrenset i sin optisk oppløsning og derfor bare tillate å nøyaktig oppdage endringer i diameter eller blod flyte i små blod mindre enn ≤ 30 µm diameter når utstyrt med mer sofistikert enheter, for eksempel et AC confocal mikroskop med fluorescerende fargestoffer eller Adaptive optikk skanning lyset oftalmoskop5,6. Videre endringer tolkningen av i vivo mål som tar sikte på å identifisere lokale signalering mekanismer i netthinnen blodkar kan bli tilbakevist av anestesimidler, i systemisk blodtrykk og påvirkning av retrobulbar blodkar.
Derfor utviklet vi en metode for å måle svar av musen retinal blod fartøy med høy optisk oppløsning ex vivo. Teknikken presenteres her kan visualisering av netthinnen arterioler via overføres * lys. Denne metoden, som kan også brukes i rotter, gir tilgang til fordelene av genet målretting teknologi i okulær vaskulær forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Måling av vaskulær svar i musen netthinnen er utfordrende på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar. Med presentert teknikken, er netthinnen arterioler visualisert ved overført * lys. Dette er mulig fordi isolert netthinnen er gjennomsiktig. Fordelen med teknikken er høy optisk oppløsning. Den beregnede romlig oppløsningen er 11 px/µm. Men er den virkelige oppløsningen for optisk system som bruker hvitt lys mellom 200 og 300 nm, som forklares ved Abbe Diffraksjon grensen. Siden den første grenen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Ernst und Berta Grimmke Stiftung og Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hunden).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
