Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur
Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til at registrere både senescent og pluripotente stamceller i skeletmuskulatur ved skade mens inducerende i vivo omprogrammering. Denne metode er velegnet til evaluering af cellulære gulne rolle under vævsregeneration og omprogrammering i vivo.
Abstract
Cellulære ældning er en stress-reaktion, der er karakteriseret ved en stabil cellulære vækst anholdelse, hvilket er vigtigt for mange fysiologiske og patologiske processer, som kræft og aldring. For nylig, gulne har også været impliceret i væv reparation og regeneration. Derfor er det blevet mere og mere kritisk at identificere senescent celler i vivo. Gulne-associerede β-galactosidase (SA-β-Gal) assay er den mest udbredte assay til at opdage senescent celler både i kulturen og i vivo. Denne analyse er baseret på øget lysosomale indholdet i de senescent celler, der tillader histokemiske påvisning af lysosomale β-galactosidase aktivitet ved suboptimum pH (6 eller 5.5). I forhold til andre assays, såsom flowcytometri, dette giver mulighed for identificering af senescent celler i deres bopæl miljø, som tilbyder værdifulde oplysninger som lokationen vedrørende væv arkitektur, morfologi, og den muligheden for kobling med andre markører via Immunhistokemi (IHC). Den største begrænsning af SA-β-Gal assay er kravet om friske eller frosne prøver.
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at forstå, hvordan cellulær gulne fremmer cellulær plasticitet og væv revitalisering in vivo. Vi bruger SA-β-Gal til at registrere senescent celler i skeletmuskulatur ved skade, som er en veletableret system at studere vævsregeneration. Derudover bruger vi IHC for at opdage Nanog, en markør af pluripotente stamceller, i transgene musemodel. Denne protokol gør det muligt for os at undersøge og kvantificere cellulære gulne i forbindelse med induceret cellulære plasticitet og i vivo omprogrammering.
Introduction
Cellulære ældning er en form for stressrespons karakteriseret ved en stabil celle-cyklus anholdelse. I det sidste årti, har forskning fast etableret at gulne er forbundet med forskellige biologiske og patologiske processer, herunder embryonale udvikling, fibrose og organisme aldring1,2. Cellulære gulne blev først identificeret i humane fibroblaster i slutningen af deres replicative levetid udløst af Telomer afkortning3. Udover replicative stress er der mange andre stimuli, der kan fremkalde gulne, herunder DNA skader, oxidativ stress, muterede signaler og genomisk/epigenomiske ændringer, nogen som kan i sidste ende aktivere p53/p21 og/eller pRB veje til etablere og styrke permanent vækst anholdelse1. En af de vigtige egenskaber af senescent celler er, at de forbliver metabolisk aktive og håndfast udtrykke en gulne-associerede sekretoriske fænotype (SASP): sekretion af mange inflammatoriske cytokiner, vækstfaktorer og ekstracellulære matrix faktorer4. SASP faktorer er blevet foreslået til at spille en vigtig rolle i mægle og forstærke effekten ældning på grund af deres potent virkninger på at tiltrække immunceller og ændre lokale og systemiske væv miljøer1. Interessant, har gulne været for nylig foreslået at være vigtig for væv reparation og regeneration5,6. Data fra flere laboratorier, herunder vores, har derudover foreslået, at væv skader-induceret gulne kan øge cellulære plasticitet, via SASPs, skal fremme regenerering7–9. Derfor, alle de nye data fremhæve vigtigheden af at studere gulne in vivo.
I post inducerede pluripotente stamceller (iPSC) æra er cellulære plasticitet en celle kapacitet til at erhverve en ny identitet og til at vedtage en alternativ skæbne når de udsættes for forskellige stimuli både i kulturen og i vivo10. Det er kendt, at fuld omprogrammering kan være opnået i vivo11,12, hvor udtryk for den kassetten som indeholder fire Yamanaka faktorer: Oct4, Sox2, Klf4og c-Myc (OSKM) kan være induceret i vivo at fremme Teratomer dannelse i flere organer. Derfor kan en omprogrammerbar musemodel (i4F) bruges som et kraftfuldt system til at identificere kritiske regulatorer og veje, der er vigtig for cellulære plasticitet11.
En egnet og følsomme i vivo system er vigtigt at forstå, hvordan cellulær gulne regulerer cellulær plasticitet i forbindelse med væv revitalisering. Her præsenterer vi et robust system og en detaljeret protokol til at vurdere sammenhængen mellem ældning og cellulære plasticitet i forbindelse med væv revitalisering. Kombination af cardiotoxin (CTX) inducerede muskelskader i Tibialis Anterior (TA) muskelgruppe, en veletableret system at studere vævsregeneration og musemodel i4F giver mulighed for påvisning af både cellulære gulne og in vivo omprogrammering under muskel regenerering.
For at vurdere sammenhængen mellem cellulære plasticitet og ældning, er i4F mus såret med CTX at fremkalde akut muskelskader og behandlet med doxycyklin (0,2 mg/mL) over 7 dage til at fremkalde i vivo omprogrammering. Mens en CTX induceret akut muskelskader og regenerering protokol har været for nylig offentliggjort13, af etiske grunde, udelades denne procedure i den nuværende protokol. TA muskel prøver vil blive indsamlet på 10 dage post skade13, når toppen af senescent celler har været tidligere observeret14. Her, beskriver denne detaljerede protokol alle foranstaltninger til at vurdere omfanget af gulne (via SA-β-Gal) og omprogrammering (via IHC farvning af Nanog).
Gulne-associerede beta-galactosidase (SA-β-Gal) assay er de mest almindeligt anvendte analyse til at opdage senescent celler både i kulturen og i vivo15. Sammenlignet med andre assays, SA-β-Gal analysen giver mulighed for identifikation af de senescent celler i deres oprindelige miljø med intakt væv arkitektur, som er særlig vigtig for i vivo undersøgelse. Derudover er det muligt at koble SA-β-Gal assay med andre markører ved hjælp af IHC. Men SA-β-Gal analysen kræver friske eller frosne prøver, der fortsat er en stor begrænsning. Når frisk eller frossen væv er rutinemæssigt rådighed, såsom frosne TA muskel prøver, er SA-β-Gal naturligvis den mest egnede assay til at opdage senescent celler. Nanog er den markør, der anvendes til at påvise reprogramed celler af to årsager: 1) det er en vigtig markør for pluripotency; 2) endnu vigtigere er dets udtryk er ikke drevet af doxycyclin (dox), derfor det registrerer induceret pluripotency snarere end tvungne udtryk for Yamanaka kassette.
Det er vigtigt at bemærke, farvningsprotokoller præsenteret i denne undersøgelse kan foretages separat for at forenkle kvantificering, men kan også gøres i en co farvning procedure at visualisere både senescent og pluripotente stamceller på samme afdeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer her, en metode til at registrere både senescent og pluripotente stamceller i skeletmuskulatur af omprogrammerbar mus. Denne metode kan bruges til at evaluere og kvantificere både gulne og fremkalde cellulære plasticitet i vivoog undersøge rollen af gulne i væv reparation og regeneration.
I den nuværende protokol bruges gulne-associerede β-galactosidase (SA-β-Gal) analysen til at påvise i vivo senescent celler i den skeletmuskulatur. Denne analyse regi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi står i gæld til Clemire Cimper for hendes fremragende teknisk support. Arbejde i laboratoriet af H.L. blev finansieret ved Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche videnskabelig, og den Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d’Excellence Revive, Investissement d’Avenir; ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) og Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. og A.C. er finansieret af Ph.D. og postdoc stipendier fra genoplive konsortiet.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
Riferimenti
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
