चोट प्रेरित वार्धक्य के मूल्यांकन और कंकाल की मांसपेशी में Vivo reprogramming में
Summary
यहां हम चोट पर कंकाल की मांसपेशी में दोनों होनेवाला और pluripotent स्टेम कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है, जबकि vivo reprogramming में उत्प्रेरण । यह विधि ऊतक पुनर्जनन और vivo मेंreprogramming के दौरान सेलुलर वार्धक्य की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त है ।
Abstract
सेलुलर वार्धक्य एक तनाव प्रतिक्रिया है कि एक स्थिर सेलुलर विकास गिरफ्तारी, जो कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं, जैसे कैंसर और उंर बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है की विशेषता है । हाल ही में वार्धक्य को टिशू रिपेयर और पुनर्जनन में भी फंसाया गया है । इसलिए, विवो मेंहोनेवाला कोशिकाओं की पहचान के लिए यह तेजी से अहम हो गया है । वार्धक्य-जुड़े β-galactosidase (SA-β-Gal) परख है सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख दोनों संस्कृति में होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए और vivo में। यह परख होनेवाला कोशिकाओं में वृद्धि हुई लाइसोसोमल सामग्री पर आधारित है, जो लाइसोसोमल β-galactosidase गतिविधि के उप इष्टतम पीएच (6 या ५.५) में histochemical का पता लगाने की अनुमति देता है । ऐसे प्रवाह cytometry के रूप में अंय परख, के साथ तुलना में, यह उनके निवासी वातावरण में होनेवाला कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है, जो इस तरह के ऊतक वास्तुकला से संबंधित स्थान के रूप में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है, आकृति विज्ञान, और immunohistochemistry (आइएचसी) के माध्यम से अन्य मार्करों के साथ युग्मन की संभावना. एसए के प्रमुख सीमा-β-लड़की परख ताजा या जमे हुए नमूनों की आवश्यकता है ।
यहां, हम कैसे सेलुलर वार्धक्य सेलुलर प्लास्टिक और vivo मेंऊतक पुनर्जनन को बढ़ावा देता है समझने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम एसए का उपयोग-β-लड़की चोट है, जो एक अच्छी तरह से स्थापित करने के लिए ऊतक पुनर्जनन अध्ययन प्रणाली है पर कंकाल की मांसपेशी में होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए । इसके अलावा, हम एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में Nanog, pluripotent स्टेम कोशिकाओं के मार्कर का पता लगाने के लिए आइएचसी का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल हमें की जांच करने और प्रेरित सेलुलर प्लास्टिक और vivo reprogramming में के संदर्भ में सेलुलर वार्धक्य मात्रा में सक्षम बनाता है ।
Introduction
सेलुलर वार्धक्य तनाव प्रतिक्रिया का एक रूप है एक स्थिर कोशिका चक्र की गिरफ्तारी की विशेषता । पिछले दशक में, अनुसंधान मजबूती से स्थापित किया है कि वार्धक्य भ्रूण विकास, फाइब्रोसिस सहित विभिन्न जैविक और रोग प्रक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है, और1उम्र बढ़ने जीव,2. सेलुलर वार्धक्य पहले मानव fibroblasts में उनकी प्रतिकृति उंर के अंत में पहचाना गया था telomere छोटा करने से ट्रिगर3। प्रतिकृति तनाव के अलावा, वहां कई अंय उत्तेजनाओं कि डीएनए क्षति, oxidative तनाव, oncogenic संकेतों, और जीनोमिक/epigenomic परिवर्तन, जिनमें से कोई भी अंततः p53/p21 और/या pRB रास्ते को सक्रिय कर सकते है सहित वार्धक्य पैदा कर सकता है स्थापित करने और स्थाई विकास की गिरफ्तारी के मजबूत1। होनेवाला कोशिकाओं की महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक यह है कि वे चयापचय सक्रिय रहते है और मजबूती से एक वार्धक्य-जुड़े स्रावी phenotype (SASP): कई भड़काऊ साइटोकिंस के स्राव, विकास कारकों, और extracellular मैट्रिक्स व्यक्त कारक4. SASP कारकों के लिए मध्यस्थता और वार्धक्य प्रभाव बढ़ाना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का प्रस्ताव किया गया है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आकर्षित करने और स्थानीय और प्रणालीगत ऊतक milieus में फेरबदल पर उनके शक्तिशाली प्रभाव के कारण1. दिलचस्प है, वार्धक्य हाल ही में ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन5,6के लिए महत्वपूर्ण होना प्रस्तावित किया गया है । इसके अलावा, हमारे सहित कई प्रयोगशालाओं से डेटा, सुझाव दिया है कि ऊतक क्षति प्रेरित वार्धक्य सेलुलर प्लास्टिक की वृद्धि हो सकती है, SASPs के माध्यम से, पुनर्जनन7–9को बढ़ावा देने के लिए । इसलिए, सभी उभरते आंकड़ों vivo मेंअध्ययन वार्धक्य के महत्व पर प्रकाश डाला ।
पोस्ट में प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) युग, सेलुलर प्लास्टिक एक सेल की क्षमता के लिए एक नई पहचान प्राप्त करने और एक वैकल्पिक जब दोनों संस्कृति में अलग उत्तेजनाओं और vivo में10से अवगत कराया भाग्य को अपनाने है । यह ज्ञात है कि पूर्ण reprogramming vivo11,12 मेंप्राप्त किया जा सकता है, जहां चार यामानाका कारकों से युक्त कैसेट की अभिव्यक्ति: Oct4, Sox2, Klf4, और सी-Myc (OSKM) कई अंगों में teratomas गठन को बढ़ावा देने के लिए vivo में प्रेरित किया जा सकता है । इसलिए, एक reprogramming माउस मॉडल (i4F) एक शक्तिशाली प्रणाली के रूप में महत्वपूर्ण नियामकों और रास्ते है कि सेलुलर प्लास्टिक की11के लिए महत्वपूर्ण है की पहचान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
एक उपयुक्त और vivo में संवेदनशील प्रणाली को समझने की कैसे सेलुलर वार्धक्य ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में सेलुलर प्लास्टिक को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है । यहाँ, हम एक मजबूत प्रणाली और ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में वार्धक्य और सेलुलर प्लास्टिक के बीच कड़ी का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । Tibialis पूर्वकाल (टीए) मांसपेशी समूह में cardiotoxin (CTX) प्रेरित मांसपेशी क्षति का संयोजन, ऊतक पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणाली, और i4F माउस मॉडल, दोनों सेलुलर वार्धक्य का पता लगाने की अनुमति देता है और vivo में मांसपेशियों के उत्थान के दौरान reprogramming ।
सेलुलर प्लास्टिक और वार्धक्य के बीच लिंक का मूल्यांकन करने के लिए, i4F चूहों तीव्र मांसपेशी क्षति पैदा करने के लिए CTX के साथ घायल हो गए हैं और 7 दिनों से अधिक doxycycline (०.२ मिलीग्राम/एमएल) के साथ इलाज vivo reprogramming में प्रेरित करने के लिए । जबकि एक CTX प्रेरित तीव्र मांसपेशी क्षति और पुनर्जनन प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित किया गया है13, नैतिक कारणों के लिए, इस प्रक्रिया को वर्तमान प्रोटोकॉल में लोप हो जाएगा । टीए मांसपेशी नमूने 10 दिन चोट के बाद13में एकत्र किया जाएगा, जब होनेवाला कोशिकाओं के शिखर पहले14मनाया गया है । यहाँ, इस विस्तृत प्रोटोकॉल वार्धक्य के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक सभी चरणों का वर्णन करता है (सा के माध्यम से-β-लड़की) और reprogramming (Nanog के आइएचसी धुंधला के माध्यम से).
वार्धक्य-जुड़े बीटा-galactosidase (एसए-β-लड़की) परख सबसे अधिक इस्तेमाल किया परख है होनेवाला कोशिकाओं दोनों संस्कृति में और vivo मेंपता लगाने के लिए15। अंय परख की तुलना में, SA-β-लड़की परख बरकरार ऊतक वास्तुकला, जो vivo अध्ययन में के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के साथ अपने पैतृक वातावरण में होनेवाला कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है । इसके अलावा, यह जोड़ी के लिए संभव है सा-β-अंय मार्करों के साथ आइएचसी का उपयोग कर लड़की परख । हालांकि, SA-β-लड़की परख ताजा या जमे हुए नमूनों की आवश्यकता है, जो एक प्रमुख सीमा बनी हुई है । जब ताजा या जमे हुए ऊतकों को नियमित रूप से उपलब्ध हैं, ऐसे जमे हुए टा मांसपेशी नमूने के रूप में, एसए-β-लड़की जाहिर है सबसे उपयुक्त परख होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए है । Nanog दो कारणों के लिए reprogramed कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया मार्कर है: 1) यह pluripotency के लिए एक अनिवार्य मार्कर है; 2) अधिक महत्वपूर्ण बात, अपनी अभिव्यक्ति doxycycline (dox) से प्रेरित नहीं है, इसलिए यह यामानाका कैसेट की मजबूर अभिव्यक्ति के बजाय प्रेरित pluripotency का पता लगाता है ।
यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, इस अध्ययन में प्रस्तुत दाग प्रोटोकॉल ठहराव प्रक्रिया को सरल करने के लिए अलग से आयोजित किया जा सकता है, लेकिन यह भी एक सह में किया जा सकता है एक ही खंड पर दोनों होनेवाला और pluripotent स्टेम कोशिकाओं कल्पना करने के लिए प्रक्रिया धुंधला ।
Protocol
पशुओं को यूरोपीय समुदाय के दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया और institute पाश्चर (CETEA) की एथिक्स कमेटी ने अनुमोदित चलत.
1. स्टॉक समाधानों की तैयारियां मांसपेशी नमूना निर्धारण के लिए सामग्?…
Representative Results
Discussion
यहां, हम reprogramming चूहों के कंकाल की मांसपेशी में दोनों होनेवाला और pluripotent स्टेम कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और दोनों वार्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए Clemire Cimper के ऋणी हैं । H.L. की प्रयोगशाला में कार्य institute पाश्चर द्वारा वित्त पोषित किया गया, केंद्र राष्ट्रीय डालो ला सूक्ष्म वैज्ञानिक, और Agence नेशनल डे ला सूक्ष्म (Laboratoire d’Excellence पुनरुद्धार, Investissement d’Avenir; ANR-10-LABX-७३), द Agence राष्ट्रीयकृत डे ला सूक्ष्म (ANR-16-CE13-0017-01) व स्नेहन चाप (PJA २०१६१२०५०२८). सीसी और एसी को पुनर्जीवित कंसोर्टियम से पीएच. डी और postdoctoral फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है ।
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
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