Utvärdering av nervskade-inducerad åldras och In Vivo omprogrammering i skelettmuskulaturen
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll att upptäcka både senescent och pluripotenta stamceller i skelettmuskulaturen vid skada samtidigt förmå i vivo omprogrammering. Denna metod är lämplig för att utvärdera rollen av cellulära åldras under vävnadsregenerering och omprogrammering i vivo.
Abstract
Cellulärt åldrande är en stressreaktion som kännetecknas av en stabil cellulära tillväxt gripandet, vilket är viktigt för många fysiologiska och patologiska processer, såsom cancer och åldrande. Nyligen, åldras har också varit inblandad i vävnad reparation och förnyelse. Därför har det blivit alltmer kritisk till identifiera senescent celler i vivo. Åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen är den vanligaste analysen att upptäcka senescent celler både kultur och i vivo. Denna analys bygger på ökad lysosomala innehållet i senescent cellerna, vilket gör histochemical detektion av lysosomala β-galaktosidas aktivitet vid suboptimum pH (6 eller 5.5). I jämförelse med andra analyser, såsom flödescytometri, Detta tillåter identifiering av senescent celler i deras inhemska miljö, som ger värdefull information såsom platsen avser vävnad arkitekturen, morfologi, och den möjlighet till koppling med andra markörer via immunhistokemi (IHC). Den största begränsningen av SA-β-Gal analysen är kravet på färska eller frysta prover.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att förstå hur cellulära åldras främjar cellulär plasticitet och vävnad förnyelse i vivo. Vi använder SA-β-Gal för att upptäcka senescent celler i skelettmuskulaturen vid skada, som är ett väl etablerat system att studera vävnadsregeneration. Dessutom använder vi IHC för att upptäcka Nanog, en markör av pluripotenta stamceller, i en transgen musmodell. Detta protokoll gör det möjligt för oss att undersöka och kvantifiera cellulära åldras i samband med inducerad cellulär plasticitet och i vivo omprogrammering.
Introduction
Cellulärt åldrande är en form av stressreaktion som kännetecknas av en stabil cellcykelarrest. Under det senaste decenniet, har forskning etablerat att åldras är associerade med olika biologiska och patologiska processer inklusive embryonal utveckling, fibros och organismen åldrande1,2. Cellulära åldras först identifierades i mänskliga fibroblaster i slutet av sin replikationsförmåga livslängd som utlöses av telomerförkortning3. Förutom replikationsförmåga stress finns det många andra stimuli som kan inducera åldras, inklusive DNA skador, oxidativ stress, onkogena signaler och genomisk/epigenetisk förändringar, något som så småningom kan aktivera p53/p21 eller pRB vägar till upprätta och förstärka den permanent tillväxt gripande1. En av de viktiga egenskaperna hos senescent celler är att de förblir metaboliskt aktiva och kraftfullt uttrycka en åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP): utsöndring av många inflammatoriska cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulär matrix faktorer4. SASP faktorer har föreslagits att spela en viktig roll i medla och förstärka åldras effekt, på grund av sin potenta effekter på att locka immunceller och förändra lokala och systemiska vävnad FOI1. Intressant, har åldras nyligen föreslagits vara viktigt för vävnad reparation och förnyelse5,6. Data från flera labs, däribland vår, har dessutom föreslagit att vävnad skada-inducerad åldras kan förbättra cellulär plasticitet, via SASPs, att främja regenerering7–9. Därför belysa alla framväxande data vikten av att studera åldras i vivo.
I inlägget inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) eran är cellulär plasticitet en cell förmåga att skaffa sig en ny identitet och att anta en alternativ öde när de utsätts för olika stimuli både i kultur och i vivo10. Det är känt att full omprogrammering kan uppnås i vivo11,12, där uttrycket av den kassett som innehåller fyra Yamanaka faktorer: Oct4, Sox2, Klf4och c-Myc (OSKM) kan vara inducerade i vivo att främja Teratom formation i flera organ. Därför kan kan programmeras om musen modell (i4F) användas som ett kraftfullt system för att identifiera kritiska regulatorer och vägar som är viktiga för cellulär plasticitet11.
En lämplig och känslig i vivo -system är viktigt att förstå hur cellulära åldras reglerar cellulär plasticitet i samband med vävnadsregeneration. Här presenterar vi ett robust system och ett detaljerat protokoll att utvärdera sambandet mellan åldras och cellulär plasticitet i samband med vävnadsregeneration. Den kombination av cardiotoxin (CTX) inducerad muskelskada i gruppen muskeln Tibialis Anterior (TA), ett väl etablerat system att studera vävnadsregenerering och i4F musmodell, tillåter upptäckt av både cellulära åldras och i vivo omprogrammering under muskel regenerering.
För att utvärdera sambandet mellan cellulär plasticitet och åldras, är i4F möss skadade med CTX inducera akuta muskelskador och behandlas med doxycyklin (0,2 mg/mL) under 7 dagar att framkalla i vivo omprogrammering. Medan en CTX inducerad akut muskelskada och regenerering protokoll har varit nyligen publicerad13, av etiska skäl, kommer detta förfarande utelämnas i det nuvarande protokollet. TA muskel prover samlas på 10 dagar post skada13, när toppen av senescent celler har observerats tidigare14. Här, beskriver denna detaljerade protokollet alla steg krävs för att utvärdera den nivå av åldras (via SA-β-Gal) och omprogrammering (via IHC färgning av Nanog).
Åldras-associerade beta-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen är den vanligaste analysen att upptäcka senescent celler både i kulturen och i vivo15. Jämfört med andra analyser, möjliggör SA-β-Gal analysen identifiering av de senescent cellerna i deras infödda miljö med intakt vävnad arkitektur, vilket är särskilt viktigt för i vivo studie. Dessutom är det möjligt att par SA-β-Gal analysen med andra markörer med IHC. Dock kräver SA-β-Gal analysen färsk eller fryst prover, som fortfarande är en stor begränsning. När färska eller frysta vävnader finns rutinmässigt, såsom frysta TA muskel prover, är SA-β-Gal uppenbarligen den mest lämpliga analysen att upptäcka senescent celler. Nanog är markören används för att upptäcka reprogramed celler av två skäl: 1) det är en viktig markör för pluripotens; 2) viktigare, dess uttryck drivs inte av doxycyklin (dox), därför den upptäcker inducerade pluripotenta i stället för uttrycket påtvingad av Yamanaka kassetten.
Det är viktigt att Observera att de olika färgprotokollen presenteras i denna studie kan ske separat för att förenkla förfarandet för kvantifiering, men kan också göras i en samtidig färgningsproceduren att visualisera både senescent och pluripotenta stamceller på samma avsnitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi en metod för att upptäcka både senescent och pluripotenta stamceller i skelettmuskulaturen kan programmeras om möss. Denna metod kan användas för att utvärdera och kvantifiera båda åldras och framkalla cellulär plasticitet i vivooch undersöka rollen som åldras i vävnad reparation och förnyelse.
I det nuvarande protokollet används åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen för att upptäcka i vivo senescent celler i skelettmusk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi står i skuld till Clemire Cimper för hennes utmärkt teknisk support. Arbete i laboratoriet för H.L. finansierades av Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche vetenskapliga, och den Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d’Excellence Revive, Investissement pris; ANR-10-labx-73), den Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) och Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. och A.C. finansieras av Ph.D. och postdoktorala stipendier från återuppliva konsortiet.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
Riferimenti
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
