Qui presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico dopo un danno mentre induce in vivo riprogrammazione. Questo metodo è adatto per valutare il ruolo della senescenza cellulare durante rigenerazione tissutale e riprogrammazione in vivo.
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Articolo metodologico
Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La senescenza cellulare è una risposta di sforzo che è caratterizzata da un arresto della crescita cellulare stabile, che è importante per molti processi fisiologici e patologici, quali il cancro e invecchiamento. Recentemente, la senescenza è stata implicata anche nella rigenerazione e riparazione tissutale. Di conseguenza, è diventato sempre più importante per identificare cellule senescenti in vivo. Analisi di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è il test più ampiamente usato per rilevare le cellule senescenti, sia in coltura che in vivo. Questa analisi è basata sul contenuto lysosomal aumentato nelle cellule senescenti, che permette la rilevazione istochimica di attività lisosomiale della β-galattosidasi a pH trovata (6 o 5.5). In confronto con altri dosaggi, come la citometria a flusso, ciò permette l'individuazione delle cellule senescenti nel loro ambiente residente, che offre importanti informazioni come la posizione relativa all'architettura del tessuto, la morfologia e la possibilità di abbinamento con altri marcatori tramite immunoistochimica (IHC). La limitazione principale del saggio SA-β-gallone è il requisito di campioni freschi o congelati.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per comprendere la senescenza cellulare come promuove la rigenerazione di tessuto e plasticità cellulare in vivo. Utilizziamo SA-β-gallone per rilevare cellule senescenti in muscolo scheletrico dopo un danno, che è un sistema ben consolidato per studiare la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, utilizziamo IHC per rilevare Nanog, un marcatore delle cellule staminali pluripotenti, in un modello di topo transgenico. Questo protocollo consente di esaminare e quantificare la senescenza cellulare nel contesto della plasticità cellulare indotto e in vivo di riprogrammazione.
Introduzione
La senescenza cellulare è una forma di risposta allo stress, caratterizzata da un arresto del ciclo cellulare stabile. Nell'ultimo decennio, la ricerca ha fermamente stabilito che la senescenza è associata con vari processi biologici e patologici, compreso lo sviluppo embrionale, la fibrosi e organismo invecchiamento1,2. La senescenza cellulare è stata identificata in fibroblasti umani alla fine della loro durata di vita ripetitiva innescato da3di riduzione del telomero. Oltre lo stress ripetitivo, ci sono molti altri stimoli che possono indurre senescenza, inclusi danni DNA, stress oss....
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Protocollo
gli animali sono stati trattati secondo le linee guida della Comunità europea e il comitato etico, dei protocolli Institut Pasteur (CETEA) approvato.
1. preparazione delle soluzioni Stock
- preparare i materiali per la fissazione del campione di muscolo. Sciogliere 0,5 g di adragante con 20 mL di acqua a temperatura ambiente per rendere il supporto l'incorporamento di congelamento per la fissazione del muscolo.
- Preparare le soluzioni per la colorazione del SA-β-gallone.
- Preparare le soluzioni di riserva di K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), ....
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Risultati
Rilevare la senescenza cellulare indotta da lesione muscolare
Recentemente è stato dimostrato che la lesione del muscolo induce senescenza cellulare transitoria14. A 10 giorni post-infortunio (DPI), la maggior parte dei myofibers danneggiati è in fase di rigenerazione con nuclei in posizione centrale, un segno distintivo della rigenerazione delle fibre muscolari, e l'architettura del muscolo viene ristabilit.......
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Discussione
Qui, presentiamo un metodo per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico di topi riprogrammabili. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per valutare e quantificare sia senescenza e indurre la plasticità cellulare in vivoed esaminare il ruolo della senescenza in rigenerazione e riparazione tissutale.
Nel protocollo attuale, l'analisi di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è usata per rilevare in vivo le cellule sene.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Siamo grati a Clemire Cimper per il suo eccellente supporto tecnico. Lavoro nel laboratorio di H.L. è stato finanziato dal Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche scientifica e l'Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) e la Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. e C.A. sono finanziate con il dottorato di ricerca e borse di studio post-dottorati dal Consorzio rivivere.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | Per SA-β Soluzione colorante Gal |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | Per SA-β Soluzione colorante Gal |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | Per SA-β Soluzione colorante Gal |
| X-Gal | Sigma | B4252 | per SA-β Soluzione colorante Gal |
| Doxiciclina | Sigma | D3447 | Per indurre la riprogrammazione in vivo |
| Cardiotossina | Lotaxan Valence, Francia | L8102 | Per lesioni muscolari |
| Glutaraldeide | Sigma | 111-30-8 | Per soluzione di fissazione |
| Paraformaldeide | Microscopia elettronica scienza | 50-980-487 | Per soluzione di fissazione |
| NaCitrato : Citrato di sodio monobasico bioxtra, anidre | Sigma | 18996-35-5 | Per soluzione di permeabilizzazione |
| Triton | Sigma | 93443 | Per soluzione di permeabilizzazione |
| Siero bovino Albumina | Sigma | A3608 | Soluzione di lavaggio |
| Anticorpo anti-Nanog | Segnalazione cellulare | 8822S | Anticorpo monoclonale di coniglio |
| Kit EnVision+ (HRP. Coniglio. DAB+) | Dako | K4010 | Per Nanog rivelazione |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Controcolorazione |
| Rosso veloce | Vector Laboratories | H-3403 | Controcolorazione |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Soluzione di montaggio |
| Mezzo di montaggio a indurimento rapido per microscopia : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Soluzione di montaggio |
| Microscopio Contrasto di fase Campo chiaro CKX41: obiettivi 10X-20X-40X | Microscopio Olympus | CKX41 | per quantificazione Nanog |
| Topo: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Modello di topo riprogrammabile |
| Muscolo scheletrico, tibiale Scanner per | |||
| Zeiss | Axio Scan Z1 | scansione di diapositive |
Riferimenti
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2....
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Ristampe e permessi
