Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli

Sommario

Qui presentiamo un metodo per misurare direttamente il RNA di trasferimento carica livelli da purificato Escherichia coli RNA così come un modo per confrontare i livelli relativi di RNA di trasferimento, o qualsiasi altri RNA breve, attraverso diversi campioni basati sull'aggiunta di spike-a cellule che esprimono un gene di riferimento.

Abstract

RNA transfer (tRNA) è una parte essenziale dell'apparato traduzionale in qualsiasi organismo. tRNAs legano e trasferire gli aminoacidi al ribosoma traduzione. I livelli relativi di tRNAs differenti ed il rapporto di aminoacylated tRNA per tRNA totale, conosciuto come il livello di carico, sono fattori importanti nel determinare l'accuratezza e la velocità di traduzione. Di conseguenza, l'abbondanza e livelli di carica di tRNAs sono variabili importanti per misurare quando si studia la sintesi delle proteine, ad esempio in varie condizioni di stress. Qui, descriviamo un metodo per la raccolta del tRNA e misurando direttamente l'abbondanza relativa e il livello di carico assoluto di determinate specie di tRNA in Escherichia coli. Il tRNA è raccolto in modo tale che il legame labile tra il tRNA e l'aminoacido è conservato. il RNA è quindi sottoposto a elettroforesi su gel e Northern blotting, che si traduce nella separazione dei tRNAs cariche e scariche. I livelli di specifici tRNAs nei diversi campioni possono essere paragonati a causa dell'aggiunta di spike-a celle per la normalizzazione. Prima Purificazione RNA, aggiungiamo 5% delle cellule di Escherichia coli che overproduce la rara di tRNA^selC a ciascun campione. La quantità di specie di interesse in un campione di tRNA è poi normalizzata alla quantità di tRNA^selC nello stesso campione. Aggiunta di spike-in cellule prima Purificazione RNA ha il vantaggio rispetto alla aggiunta di purificato RNA spike-in che è anche responsabile di eventuali differenze di efficienza di lisi delle cellule fra i campioni.

Introduzione

Di seguito, presentiamo un metodo per quantificare specifico tRNAs e misurare la loro carica livelli mediante Northern blotting. Il metodo si basa su una tecnica sviluppata da Varshney et al. ¹. raccolta delle cellule in acido tricloroacetico (TCA) e mantenere i campioni a 0 ° C durante la purificazione di RNA, il legame estere tra il tRNA e l'aminoacido è conservata^2,3,4. Aminoacylated tRNAs si distinguono dalle loro controparti nonacylated gel elettroforesi e macchiare nordico, dovuto ad una mobilità in diminuzione del aminoacylated tRNA nel....

Protocollo

1. preparazione delle colture batteriche.

1. Crescere tutte le culture in matracci di Erlenmeyer con un rapporto di volume matraccio di cultura al massimo 1/6. In una tipica configurazione sperimentale, crescono le culture a 37,0 ° C e scuotendo a 160 giri/min in morpholinepropanesulfonic acido (MOPS) minimo medio ¹⁸ completati con la fonte di carbonio preferito, ad esempio 0,2% glucosio, per almeno 10 generazioni successive prima raccolta RNA.
2. Il giorno prima della raccolta del RNA, diluire una cultura sovrasviluppata del ceppo desiderato in MOPS medium minimo in modo che raggiungerà la desiderata OD ₄₃₆ al moment....

Risultati

Utilizzando la procedura descritta qui, l'abbondanza e ricarica i livelli di tre tRNAs sono stati misurati in e. coli K-12 prima e durante l'inedia dell'aminoacido.

Il auxotroph di arginina ceppo NF915⁴ (thr leu suo argH thi mtl supE44) è stato coltivato per almeno dieci generazioni in MOPS supplementato con 0,4% glicerolo, 50 µ g/mL treonina, leucina, arginina e istidina di 5 µ g/mL a 3.......

Discussione

Questo protocollo descrive come misurare contemporaneamente il livello di carico delle specifiche Escherichia coli tRNAs e confrontare i livelli relativi dei tRNAs in diversi campioni. I punti critici del protocollo sono 1) per gestire i campioni in modo che i livelli di carica tRNA cellulare vengono mantenuti, 2) per normalizzare la quantità di tRNA in modo tale che i livelli relativi di tRNA in diversi campioni possono essere paragonati in modo affidabile e 3) per garantire la sp ecificity delle sonde selezion.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Urea	Merck	57-13-6	Purezza >99%
Poliacrilammide	Serva	79-06-7
Bis (N,N'-Metilene-bis-acrilammide)	BIO-RAD	161-0201
Acido tricloroacetico (TCA)	Sigma	76-03-9
Fenolo	Merck	108-95-2
IPTG
Glucosio
, Acetato
EDTA,
Etanolo
, Tris,
acido
cloruro di
NaH2PO4
Citrato
SDS
aringa sperma DNA	Sigma	100403-24-5
BSA
Polivinilpirrolidone
Ficoll
P32 γ ATP	Perkin Elmer
DNA oligo (sonde)	TAG Copenhagen
Hybond N+ membrana	GE Healthcare	RPN203B
Crosslinker
Electroblotter	BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner	GE Healthcare	28955809
Spettrofotometro
Forno
Geiger-Mü provetta per ller
Schermo imager al fosforo	GE Healthcare
Provetta
Fiasche
			microcentrifuga da 1,5
ml Provette per centrifuga da 20 ml
strong>Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Software
ImageQuant	GE Healthcare
Excel	Microsoft

di sodio,cloridrico, sodio, di sodiodi idratazioneper ibridazionedi colturaProvette per<