इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य का वर्णन कैसे लेजर microirradiation का उपयोग करने के लिए डीएनए क्षति के विभिंन प्रकार के प्रेरित अपेक्षाकृत सरल किनारा टूट जाता है और जटिल क्षति सहित, का अध्ययन करने के लिए डीएनए नुकसान संकेतन और vivo में नुकसान साइटों पर मरंमत फैक्टर विधानसभा .
डीएनए नुकसान सेल में विशिष्ट संकेतन और मरंमत प्रतिक्रियाओं लाती है, जो जीनोम अखंडता के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है । लेजर microirradiation एक मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण vivo मेंडीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR) की जांच करने के लिए बन गया । यह सेल नाभिक में एक submicrometer क्षेत्र तक ही सीमित लेजर प्रेरित नुकसान के जवाब में macromolecular गतिशीलता के वास्तविक समय उच्च संकल्प एकल सेल विश्लेषण की अनुमति देता है । हालांकि, विभिंन लेजर शर्तों प्रेरित नुकसान के प्रकार में मतभेदों की सराहना के बिना इस्तेमाल किया गया है । एक परिणाम के रूप में, क्षति की प्रकृति अक्सर अच्छी तरह से लक्षण या नियंत्रित नहीं है, भर्ती या संशोधन प्रोफाइल में स्पष्ट विसंगतियों के कारण । हम प्रदर्शन किया है कि विभिंन विकिरण की स्थिति (यानी, विभिंन तरंग दैर्ध्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिंन इनपुट शक्तियों (irradiances) के पास एक femtosecond (एफएस) के पास अवरक्त (NIR) लेजर) अलग DDR और मरंमत प्रोटीन विधानसभाओं प्रेरित किया । यह डीएनए के प्रकार का उत्पादन नुकसान को दर्शाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे अनुमापन लेजर इनपुट शक्ति के विभिंन मात्रा और डीएनए क्षति की जटिलताओं, जो आसानी से आधार और crosslinking नुकसान, अंतर पाली (ADP ribose) (सममूल्य) संकेत का पता लगाने के द्वारा निगरानी कर सकते है की प्रेरण की अनुमति देता है, और मार्ग-विशिष्ट मरंमत फैक्टर नुकसान साइटों पर विधानसभाओं । एक बार नुकसान की स्थिति निर्धारित कर रहे हैं, यह अलग नुकसान जटिलता और अंतर के रूप में अच्छी तरह से ब्याज के किसी भी पहलू पर ऊपर कारक (एस) की कमी संकेतन नुकसान के प्रभाव की जांच संभव है ।
Vivo में डीएनए क्षति संकेतन अच्छी तरह से समझ नहीं है
vivo में, डीएनए histones और अन्य कारकों क्रोमेटिन फाइबर के रूप में के साथ जटिल है. क्रोमेटिन संरचना का विनियमन डीएनए चयापचय के लिए सर्वोपरि महत्व का है । उदाहरण के लिए, citrullinated वैरिएंट H2AX द्वारा phosphorylated है गतिभंग-telangiectasia (एटीएम) और अन्य kinases निम्नलिखित डबल-किनारा टूटता है (DSB) प्रेरण, और DSB क्षति संकेत प्रवर्धन के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य के लिए एक डॉकिंग साइट प्रदान करने के रूप में कारकों. क्षति सिग्नलिंग और मरंमत मार्ग पसंद के प्रसार को गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त साइटों पर स्थानीय क्रोमेटिन संरचना से प्रभावित हो1। क्रोमेटिन remodeling कारकों में से एक नंबर, citrullinated chaperones, और citrullinated संशोधित एंजाइमों वास्तव में नुकसान साइटों को भर्ती कर रहे है और कुशल डीएनए की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्रोमेटिन में DDR विनियमन के महत्व पर प्रकाश डाला और2 मरंमत , 3 , 4. इसके अलावा, क्षति साइट clustering या स्थिति खमीर और drosophila5,6,7,8, में जीन loci के स्थानीयकरण की याद ताजा में मनाया गया था उपपरमाणु डिब्बा जीन विनियमन9,10के साथ जुड़े । माउस और मानव कोशिकाओं में हाल के अध्ययनों से भी DSB साइटों, जो मरंमत निष्ठा और मार्ग विकल्प11,12प्रभाव का जमावड़ा पता चला । यह संभावना है कि DDR/मरंमत भी परिचित परमाणु वास्तुकला, उच्च क्रम क्रोमेटिन संगठन, और कोशिका नाभिक में गुणसूत्र गतिशीलता से जुड़ा हो सकता है उठाती है । इस प्रकार, यह उच्च संकल्प तरीकों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है के लिए एक जीवित कोशिका में अंतर्जात परमाणु पर्यावरण के संदर्भ में DDR और मरंमत की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए कम समझ और दीर्घकालिक डीएनए क्षति के परिणाम ।
Gauging में सममूल्य पोलीमरेज़ (प्प) की महत्वपूर्ण भूमिका हद तक और नुकसान के प्रकार और नुकसान स्थल पर प्रोटीन विधानसभा विनियमन
PARP1 एक डीएनए निक संवेदक तेजी से डीएनए क्षति है कि डीएनए की मरंमत13में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता द्वारा सक्रिय है । PARP1 मूलतः एक्स के साथ कार्य करने के लिए सोचा था रे मरंमत पार 1 पूरक (XRCC1) के आधार पर उत्पाद शुल्क की मरंमत (मांक) की सुविधा है, लेकिन हाल के अध्ययनों से अंय डीएनए मरंमत रास्ते में अपनी भूमिका प्रकट DSB मरंमत सहित14। सक्रिय PARP1 का उपयोग करता है nicotinamide adenine dinucleotide (णड+) के रूप में एक सब्सट्रेट करने के लिए ADP-ribosylate खुद सहित कई लक्ष्य प्रोटीन, । इस एंजाइम और परिवार के अंय सदस्यों प्प अवरोधकों के रूप में हाल के वर्षों में ज्यादा ध्यान आकर्षित किया है कैंसर के लिए चिकित्सकीय दवाओं के होनहार के रूप में उभरा है । हालांकि प्प अवरोधकों शुरू में स्तन कैंसर जीन में प्रभावी होना पाया गया (BRCA)-स्तन कैंसर की कोशिकाओं में रूपांतरित हो, वहां अब मोनो में अपने प्रभाव के लिए सबूत के ढेर सारे है और डीएनए के साथ संयोजन चिकित्सा हानिकारक एजेंटों/ उत्परिवर्तनों के साथ कैंसर का एक व्यापक स्पेक्ट्रम BRCA15,16,17,18,19,20के लिए सीमित नहीं है ।
आणविक स्तर पर, प्प सक्रियण क्षतिग्रस्त स्थलों पर स्थानीय क्रोमेटिन संरचना के आयोजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया था । बराबर क्रोमेटिन संशोधन एंजाइमों के आश्रित भर्ती DSB मरंमत की सुविधा और मरंमत मार्ग विकल्प हुक्म, नुकसान स्थलों पर बराबर संशोधन के महत्वपूर्ण मचान भूमिका का सुझाव । 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 हम हाल ही में p53-बाध्यकारी प्रोटीन 1 के अपवर्जन (53BP1) बराबर ३२से नुकसान साइटों से प्रदर्शन, 53BP1 के लिए एक वैकल्पिक विवरण प्रदान गैर मुताबिक़ endjoining के आश्रित hyperactivation ( NHEJ) द्वारा प्प अवरोध करनेवाला और DSB मरम्मत मार्ग विकल्प में प्प के महत्व पर प्रकाश डाला३३,३४. PARP1 भी सीधे PARylates और कई डीएनए की मरंमत कारकों की गतिविधि को प्रभावित करता है14।
Vivo में DDR/मरंमत का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में लेजर Microirradiation का प्रयोग
व्यक्तिगत गुणसूत्रों पर उप-माइक्रोन परिवर्तन का उत्पादन करने के लिए लेजर microirradiation पहले १९६९३५ में वर्णित किया गया था और १९८१३६में विस्तार से समीक्षा की । कई दशकों बाद, लेजर microirradiation कोशिका नाभिक में एक परिभाषित submicrometer क्षेत्र में डीएनए क्षति प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था, और एक मूल्यवान तकनीक भर्ती या vivo में डीएनए घावों के लिए विभिन्न कारकों के संशोधनों का अध्ययन करने के लिए सिद्ध किया गया था 13 , ३७ , ३८ , ३९ , ४० , ४१. इस विधि से उन कारकों का पता लगाने की अनुमति देता है जो विशिष्ट विकिरण-प्रेरित घावों (IRIF) को क्षति साइटों३९,४२पर नहीं बनाते हैं । यह भी क्षति साइटों पर दोनों और नाभिक के बाकी हिस्सों में क्रोमेटिन संरचनात्मक परिवर्तन की spatiotemporal गतिशीलता की जांच करने के लिए संभव है । हम ध्यान से विभिंन लेजर प्रणालियों और इनपुट शक्तियों द्वारा प्रेरित DDRs की तुलना में डीएनए क्षति के प्रकार और microirradiation स्थितियों के बीच संबंध का मूल्यांकन करने के लिए३२,४३,४४, ४५. 53BP1 और telomeric के ंयायपालिका भर्ती पैटर्न दोहराने बाध्यकारी कारक 2 (TRF2) पिछले लेजर क्षति अध्ययन में मनाया गया, जो “गैर शारीरिक” लेजर की प्रकृति-प्रेरित नुकसान के लिए आवर्ती चिंता का आधार प्रदान की४६ ,४७,४८,४९. हमने पाया है कि इन स्पष्ट विसंगतियों अब अंतर प्प द्वारा समझाया जा सकता है जो संकेत है कि राशि और प्रेरित नुकसान की जटिलता३२गेज । हम पुष्टि की है कि: 1) लेजर-microirradiated कोशिकाओं (उच्च इनपुट-पावर विकिरण के बाद भी) एक क्षति चौकी नियंत्रण पर निर्भर तरीके से चरण में गिरफ्तार कर रहे हैं और (कम से ४८ ज)३२,५०के लिए व्यवहार्य बने रहते हैं; और 2) मरंमत कारक भर्ती/ईमानदारी पारंपरिक डीएनए हानिकारक एजेंटों और DSB प्रेरण के साथ endonucleases३२,३९,४२द्वारा उपचार के साथ मनाया उन दोहराऊंगा, ४४,५०,५१,५२. इन परिणामों को दृढ़ता से लेजर क्षति प्रेरित सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन की शारीरिक प्रासंगिकता का समर्थन ।
DDR अनुसंधान के लिए लेजर microirradiation का उपयोग करने के फायदे हैं:
1. यह जटिल डीएनए क्षति के लिए सरल किनारा टूटता से विभिन्न प्रकार और डीएनए क्षति की मात्रा पैदा करने के लिए संभव है, और लेजर विकिरण मापदंड?…
The authors have nothing to disclose.
हम Tohoku विश्वविद्यालय, GFP-NTH1 अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के लिए जापान में डॉ अकीरा Yasui, और डॉ इरोज Lazzerini Denchi स्क्रिप्स अनुसंधान संस्थान, La Jolla, कैलिफोर्निया में TRF2-YFP और EGFP-53BP11220-1711 अभिव्यक्ति plasmids के लिए धंयवाद । यह काम वायु सेना कार्यालय के वैज्ञानिक अनुसंधान (FA9550-04-1-०१०१) और Beckman लेजर संस्थान इंक द्वारा समर्थित किया गया था । फाउंडेशन (एम. डब्ल्यू. बी.), नेशनल एकेडमी ऑफ साइंसेज (बी. ए. एस.) से फोर्ड फाउंडेशन फैलोशिप, और NSF म्क्ब-१६१५७०१ और CRCC सीआरआर-17-426665 (to K. Y.).
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
Heating System | Ibidi | 10918 | |
Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
Thymidine | SIGMA | T9250 | |
serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
Excel | microsoft | spreadsheet program | |
Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |