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Genetica

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.

Abstract

DNA 損傷は、ゲノムの整合性の保護のために重大である細胞のシグナル伝達と修理の特定の応答を誘発します。レーザー microirradiation DNA 損傷応答 (DDR) は、生体内で調査する貴重な実験ツールとなりました。細胞核内のサブミクロン領域に閉じ込められたレーザ誘起損傷に応答高分子ダイナミクスの実時間高分解能単一細胞解析をことができます。ただし、損傷の種類の違いの感謝せず様々 なレーザーの条件が使用されています。その結果、損傷の性質は頻繁にはよく特徴付けられるまたは制御、採用または変更プロファイルに明白な矛盾を引き起こしています。別々 の DDR と修理蛋白質アセンブリを異なる照射条件 (すなわち波長と同様、さまざまな入力力 (域) (fs) 近赤外線 (NIR) レーザー) に誘導を行った。これは、DNA 損傷の種類を反映します。このプロトコルはどのようにレーザー入力電力の滴定により異なる量の誘導と、ベースと架橋損害、シグナル伝達、差動ポリ (adp-リボース) (PAR) の検出が簡単に監視できる DNA 損傷の複雑さについて説明しますと被害サイトで経路特定修復因子アセンブリ。被害の条件が決まったら、さまざまな損傷が複雑さと差分の損傷のシグナル伝達の効果だけでなく、関心の任意の因子に上流因子の枯渇を調査することが可能です。

Introduction

生体内でよくわかりませんが DNA 損傷のシグナル伝達
生体内でDNA はヒストンとフォーム クロマチン繊維と他の要因との複合体です。クロマチン構造の規制は、DNA 代謝に非常に重要です。たとえば、ヒストン異型 H2AX は – 毛細血管拡張性運動失調変異 (ATM) と次の二重鎖改 (DSB) 誘導と DSB 被害増幅だけでなく、他のドッキング サイトを提供することが重要です他のキナーゼによりリン酸化されます。要因。損傷シグナリングと修復経路の選択肢の広がり被害サイト1ローカル クロマチン構造に影響される批判的に表示されます。クロマチン因子、ヒストン シャペロンとヒストンの修正の酵素を再構築の数サイト被害を募集して実際に DDR でクロマチン制御の意義を強調、効率的な DNA 修理のため重要し、修復2,3,4しますさらに、クラスタ リングまたは再配置の被害サイトが観察された酵母、ショウジョウバエ5,6,7、8、内在する遺伝子座の染色体を連想させる、。遺伝子調節9,10に関連付けられている核コンパートメントです。マウスとヒトの細胞での最近の研究はまた、DSB サイト、影響を与える修復再現性と経路選択11,12の動員を明らかにしました。これは、DDR/修理も密接につながるかもしれない核内構造、高次クロマチンと染色体細胞核ダイナミクス可能性を発生させます。したがって、DDR の研究および DNA 損傷の短期および長期結果を理解するために生細胞の内因性核環境のコンテキストでプロセスを修復する高分解能手法の開発が重要です。

パー ポリメラーゼ (PARP) 測定範囲と被害の種類と被害サイトで蛋白質の集合を調節する重要な役割
化における PARP1 は急速に重要な役割を果たしている DNA 修理13DNA 損傷によって活性化 DNA ニック センサーです。化における PARP1 は x 線修理クロスを補完する 1 (XRCC1) 塩基除去修復 (BER) を容易にするとともに機能と考えられていたが、最近の研究は、DSB 修復14を含む、他の DNA 修復経路におけるその役割を明らかにします。ADP ribosylate を基質としてそれ自身を含む複数のターゲット蛋白質の化における PARP1 使用してニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD+) を活性化。PARP 阻害剤はがん治療薬として有望な浮上するいると、この酵素と他の家族のメンバーでは、近年、注目をされています。PARP 阻害剤は、乳癌の遺伝子 (BRCA) で効果を発揮する発見された当初が-乳房のがん細胞を変異と DNA 損傷に対してエージェント/照射とモノとの組み合わせ治療の効果のための証拠の茄多は今突然変異で BRCA15,16,17,18,,1920に限らず癌の広いスペクトル。

分子レベルで損傷のサイトでローカルのクロマチン構造を整理するのに重要な役割を果たす PARP 活性化を示した。クロマチン修飾酵素のパー依存型募集を容易に DSB の修復とおもむくまま修復経路の選択肢、損傷のサイトで PAR 変更の重要な足場の役割を示唆しています。13、21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30パー 32、非相同 endjoining (53BP1 依存陰嚢の代替説明を提供することによってサイトを我々 は最近、損傷から p53 結合蛋白質 1 (53BP1) の除外を示した,31NHEJ) PARP 阻害剤と DSB の PARP の意義を強調修復経路選択33,34。化における PARP1 も複数の DNA の活動を修復 PARylates、影響を与える直接の要因14。

生体内での DDR/修理勉強するツールとしてレーザー Microirradiation を使用してください。
個々 の染色体におけるサブミクロン変化を生成するレーザー microirradiation 最初 1969年35で説明され 1981年36で詳細に検討します。数十年後、レーザー microirradiation 細胞核内の定義されたサブミクロン領域での DNA 損傷を誘導することが示され、募集や DNA 病変で生体内にさまざまな要因の変更を研究する貴重な方法であることが証明されました13,37,38,39,40,41。 このメソッドの被害サイト39,42異なる照射誘起巣 (IRIF) を形成しないそれらの要因の検出が可能。また、被害現場と核の残りの部分の両方のクロマチン構造変化の時空間ダイナミクスを検討することが可能です。我々 は慎重に異なるレーザー システムによる Ddr を比較し、DNA 損傷の種類と microirradiation 条件32,43,44との関係を評価する力を入力 45。53BP1 とテロメア異常募集パターンを繰り返す結合因子 2 (TRF2) が定期的なレーザ誘起損傷46 の「生理学」の自然へ関心基盤を提供以前のレーザー損傷研究で観察された ,47,48,49。ゲージ量と損傷32の複雑さをシグナリング今差分 PARP で説明できるは、そのこれらの明白な不一致であることがわかった。確認した: 1) (高入力電力照射) 後もレーザー microirradiated 細胞が損傷チェックポイント制御依存的に中間期に逮捕され、実行可能に残る (少なくともまで 48 h)32,50;・ 2) 修復因子募集/修正を忠実に要約エンドヌクレアーゼ32,39,42、従来の DNA 有害な代理店との処置と DSB 誘導, 44,50,51,52。これらの結果は、レーザー損傷による細胞応答を勉強の生理学的な関連性を強くサポートします。

Protocol

1. 基本的なセル準備 注: この手順は、内因性のタンパク質の募集または変更、標準的な蛍光検出のため、蛍光タグ組換えタンパク質を安定に発現する細胞株を使用するためです。たとえば、私たちの前に使用された EGFP 53BP11220-1711または TRF2 YFP を安定に発現するPotorustridactylus (PtK2) 有袋類の腎臓上皮細胞研究 (図 1)32で…

Representative Results

EGFP 53BP11220-1711または TRF2 YFP を安定に発現する PtK2 セルを使用して、レーザー入力電力滴定を行った彼らの募集 (図 1)32の最適条件を決定します。 高入力出力レーザー被害サイトで基本ダメージを特異的に認識する GFP NTH1 DNA グリコシラーゼ、CPD (通常紫外線 (UV) 損傷で生成される架橋損傷) の重要なクラスタ リングが観察?…

Discussion

DDR 研究レーザー microirradiation を使用する利点は次のとおりです。

1 種類を誘導することは不可能で、複雑な DNA の損傷に単純な鎖から量の DNA の損傷を検出する DNA リペア要因はレーザー照射パラメーターを調整することによってサイトを損傷します。また、(図 3) のようにトランス効果を評価するために同じ細胞核内で複数回のダメージを与…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NTH1 GFP 発現プラスミドの東北大学、日本で博士明安井と TRF2 YFP と EGFP 53BP11220-1711発現プラスミドのラホーヤ、カリフォルニア州スクリップス研究所で博士エロス サヴィ電池に感謝しますこの作品は、空軍科学研究局 (FA9550-04-1-0101) と (M.W.B) にベックマン レーザー研究所株式会社財団、フォード財団フェローシップ CRCC と NSF MCB 1615701 (B.A.S) に科学の国民アカデミーから支えられ(K. Y.) に 426665 CRR 17

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
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Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
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