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Genetica

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

Abstract

DNA 손상 유도 게놈 무결성의 보호에 대 한 중요 한 셀에 특정 신호 및 복구 응답 합니다. 레이저 microirradiation 귀중 한 실험 도구는 DNA 손상 응답 (DDR) vivo에서조사 되었다. 레이저 유도 손상 세포 핵에 있는 submicrometer 지역에 대 한 응답에서 고분자 역학의 실시간 고해상도 단일 세포 분석을 수 있습니다. 그러나, 다양 한 레이저 조건 유도 된 손상의 종류에 있는 다름의 감사 없이 사용 되었습니다. 그 결과, 피해의 특성은 종종 잘 특징 또는 제어, 채용 또는 수정 프로필에 명백한 불일치를 일으키는. 우리는 다른 방사선 조건 (즉, 다른 파장으로 펨 (fs) 근처-적외선 (NIR) 레이저의 다른 입력된 파워 (irradiances)) 고유 DDR 및 복구 단백질 어셈블리 유도 시연 했다. 이 생산 하는 DNA 손상의 종류를 반영 한다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 레이저 입력된 전력의 적정 수 다른 금액의 유도 및 자료 및 가교 손해, 신호 처리, 차동 폴 리 (ADP-ribose) (파)의 탐지에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다, DNA 손상의 복잡 하 고 피해 사이트에서 경로 특정 복구 요소 어셈블리입니다. 손상을 조건 결정, 일단 관심의 어떤 요소에 업스트림 factor(s)의 고갈 뿐만 아니라 다른 손상 복잡성과 차동 손상 신호 전달의 효과 조사 가능 하다.

Introduction

Vivo에서 DNA 손상 신호는 잘 이해 되지
Vivo에서, DNA는 히스톤과 양식 chromatin 섬유에 다른 요인 complexed. Chromatin 구조의 규정은 DNA 물질 대사에 대 한 파라마운트의 중요성입니다. 예를 들어 히스톤 변형 H2AX 증-오점이 돌연변이 (ATM)와 다음 이중 가닥 (DSB) 유도, 휴식과 DSB 손상 신호 증폭으로 다른 도킹 사이트를 제공 하는 것이 중요 하다 다른 kinases phosphorylated은 요인입니다. 손상 신호 및 복구 통로 선택의 확산 비판적으로 피해 사이트1에서 로컬 chromatin 구조에 의해 영향을 받을 것으로 보인다. 다양 한 요인, 히스톤 보호자 및 히스톤 수정 효소를 개장 하는 chromatin 실제로 사이트 손상 모집 DDR에서 chromatin 규제의 중요성을 강조 하는 효율적인 DNA 수리를 위해 중요 한 및 복구2 , 3 , 4. 또한, 피해 사이트 클러스터링 또는 재배치 효 모와 초파리5,6,7,8, relocalization에 유전자 loci의 연상에서 관찰 되었다는 subnuclear 구획 연관 유전자 규칙9,10. 마우스와 인간 세포에 있는 최근 연구는 또한 DSB 사이트, 어느 영향 복구 충실도 및 통로 선택11,12의 동원을 공개 했다. 이 DDR/수리도 연결 될 수 있습니다 속속들이 핵 건축, 더 높은 순서 chromatin 조직과 염색체를 세포 핵에 역학 가능성 제기. 따라서, DDR을 연구 하 고 DNA 손상의 단기 및 장기 결과 이해 하기 위해서는 살아있는 세포에서 핵 생 환경에 프로세스를 복구 고해상도 방법을 개발 하기 위해 중요 하다.

파 중 합 효소 (PARP) 손상의 유형과 정도 측정 하 고 규제 피해 사이트에 단백질 조립에의 중요 한 역할
PARP1는 DNA 수리13에서 중요 한 역할을 담당 하는 DNA 손상에 의해 빠르게 활성화 DNA 닉 센서입니다. PARP1 원래 x 선 수리 크로스 보완 1 (XRCC1) 기본 절단 수 선 (BER)를 촉진 하기 위하여 함께 작동 생각 하지만 최근 연구 결과 공개 DSB 수리14를 포함 하 여 다른 DNA 복구 경로에서 역할. 자신을 포함 한 여러 대상 단백질, ADP ribosylate는 기판으로 PARP1 사용 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)을 활성화. 이 효소와 다른 가족 구성원 있다 관심을 끌었다 많은 최근 몇 년 동안에서 PARP 억제제는 암에 대 한 유망 치료 약물 등장 했습니다. PARP 억제제 처음 유 방 암 유전자 (BRCA)에 효과가 있어야 발견 했다 비록-유 방 암 세포를 돌연변이 지금 에이전트/조사에 대 한 손상 DNA와 함께 모노-및 조합 치료에 그들의 효과 대 한 증거의 과다 한입니다 BRCA15,,1617,18,19,20을 돌연변이와 암의 광범위 한 스펙트럼.

분자 수준에서 PARP 활성화 조직 손상 사이트에서 로컬 chromatin 구조에 중요 한 역할을 표시 했다. Chromatin 변경 효소의 파 종속 모집 DSB 수리를 용이 하 게 하 고 지시 복구 경로 선택, 파 수정 피해 사이트에서의 중요 한 발판 역할을 제안 합니다. 13,21,22,23,,2425,26,27,28,29, 30,31 우리는 최근 손상에서 p53 바인딩 단백질 1 (53BP1)의 배제를 시연 파 32, 비 동종 endjoining (53BP1-종속 hyperactivation에 대 한 대체 설명을 제공 하 여 사이트 NHEJ) 의해 PARP 억제제 및 DSB에 PARP의 중요성을 강조 복구 통로 선택33,34. PARP1 또한 PARylates 및 활동의 여러 DNA 복구 직접 요인14.

DDR/수리에서 Vivo에서 공부 하는 도구로 서 레이저 Microirradiation를 사용 하 여
개별 염색체에 서브 미크론 변경 생산 레이저 microirradiation 196935 에 설명 된 처음 이었고 198136에 자세히 검토. 몇 십년 후, 레이저 microirradiation 세포 핵에 정의 된 submicrometer 지역에서 DNA 손상 유도 표시 했다 고 모집 또는 수정 다양 한 요인의 DNA 병 변 비보 를 연구 하는 귀중 한 기술 입증 되었다 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41.이 메서드는 손상 사이트39,42에서 뚜렷한 방사선-유도 포커스 (IRIF)를 형성 하지 않습니다 그 요인의 탐지를 수 있습니다. 그것은 또한 손상 사이트에서 고 핵의 나머지에서 chromatin 구조 변화 spatiotemporal 역학 검사 가능. 우리는 신중 하 게 다른 레이저 시스템에 의해 유도 된 Ddr에 비해 DNA 손상의 유형 및 microirradiation 조건32,,4344, 사이의 관계를 평가 하는 능력을 입력 하 고 45. 53BP1 및 telomeric 탈 채용 패턴 반복 바인딩 요소 2 (TRF2) 레이저 유도 손상46의 “비 생리” 자연에 대 한 되풀이 우려에 대 한 기초를 제공 하는 이전 레이저 손상 연구에서 관찰 되었다 ,47,,4849. 우리는 양과 복잡성 유발된 손상32의 계기 신호 이러한 명백한 불일치 이제 차동 PARP에 의해 설명 될 수 있는 발견. 우리 확인: 1) (높은 입력 전력 조사) 후에 레이저 microirradiated 세포 손상 검사점 제어 종속 방식에서 interphase에 체포와 유지 가능한 (적어도 48 h까지)32,50; 그리고 2) 수리 계수 모집/수정 충실 하 게 그 endonucleases32,,3942에 의해 기존의 DNA 파괴적인 대리인을 가진 처리와 DSB 유도 관찰 정리 44,50,,5152. 이러한 결과 강하게 레이저 손상 유발 세포 응답의 생리 적인 관련성을 지원 합니다.

Protocol

1. 기본 셀 준비 참고:이 단계는 생 단백질 모집 또는 수정, 표준 면역 형광 감지 하 고 안정적으로 붙일 태그가 재조합 단백질을 표현 하는 셀 라인의 사용에 대 한. 예를 들어 Potorustridactylus (PtK2) 주머니 신장 상피 세포 이전에 사용 되었다 안정적 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP 표현 연구 (그림 1)32. 전자의 경우, 53BP1의 지역 형…

Representative Results

안정적으로 표현 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP PtK2 셀을 사용 하 여, 레이저 입력된 전원 적정 실시 되었다 그들의 모집 (그림 1)32에 대 한 최적의 상태를 확인 하려면. 높은 입력 파워 레이저 피해 사이트에서 구체적으로 인식 하는 베이스 손상 GFP NTH1 DNA glycosylase 뿐만 아니라 일일 (가교 손상 자외선 (UV) 손상에 의해 일반적으로 생…

Discussion

레이저 microirradiation DDR 연구에 대 한 사용의 장점은 다음과 같습니다.

1. 그것은 가능한 다양 한 종류를 유도 하 고 양의 DNA가 복잡 한 DNA 손상, 간단한 가닥 나누기에서 손상 감지 다른 수리 DNA에서 파손 사이트 레이저 조사 매개 변수를 조정 하 여. ( 그림 3)에서 트랜스 효과 평가 하기 위해 여러 번 같은 셀 핵에에서 피해를 입힐 수 이기도 합니다….

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 GFP NTH1 식 플라스 미드에 대 한 토 호 쿠 대학, 일본에서 야 스도 아키라 박사 및 박사 에로스 Lazzerini Denchi 스 크립 스 연구소, 라 Jolla, 캘리포니아 TRF2 YFP EGFP 53BP11220-1711 식 플라스 미드에 대 한 감사합니다. 이 작품은 공군 사무실의 과학적 연구 (FA9550-04-1-0101)와 베크만 레이저 연구소 Inc. 재단 (M.W.B), 과학 (B.A.S), 하 고 NSF MCB 1615701 CRCC 국립 아카데미에서 포드 기초 장학금에 의해 지원 되었다 음악원-17-426665 (K. Y.)에.

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
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Riferimenti

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Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
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