JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetica

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

Målet med detta protokoll är att beskriva hur man använder laser microirradiation att framkalla olika typer av DNA-skador, inklusive relativt enkla strand raster och komplex skada, att studera DNA skador signalering och reparation faktor församlingen vid skada platser i vivo .

Abstract

DNA-skada inducerar specifika signalering och reparation reaktioner i cellen, vilket är avgörande för skyddet av genomet integritet. Laser microirradiation blev ett värdefullt experimentella verktyg att undersöka i DNA skador svar (DDR) i vivo. Det tillåter enskild cell-högupplösta realtidsanalys av makromolekylära dynamics svar på laser-inducerad skada begränsas till en submicrometer region i cellkärnan. Dock har olika laser villkor använts utan uppskattning av skillnader i typer av skada inducerad. Som ett resultat, arten av skadan är ofta inte väl karakteriserade eller kontrolleras, orsakar uppenbar inkonsekvenser i rekrytering eller modifiering profiler. Vi visat att olika bestrålningsvillkoren (dvs, olika våglängder samt olika ingående befogenheter (irradiances) av en (fs) nära infrarött (NIR) femtosecondlaser) inducerad distinkta DDR och reparation protein församlingar. Detta återspeglar typ av DNA-skador som produceras. Det här protokollet beskriver hur titrering av laser ineffekt tillåter induktion av olika belopp och komplexiteten i DNA-skador, som enkelt kan övervakas genom påvisande av bas och crosslinking skador, differentiell poly (ADP-ribos) (PAR) signalering, och väg-specifika reparation faktor församlingar på skada platser. När skador villkoren bestäms, är det möjligt att undersöka effekterna av olika skador komplexitet och differentiell skada signalering samt utarmning av uppströms faktorer på någon faktor av intresse.

Introduction

In Vivo DNA skador signalering är inte förstått
In vivo, DNA är komplex med histoner och andra faktorer till formuläret kromatin fibrer. Reglering av kromatinstruktur är av avgörande betydelse för DNA ämnesomsättning. Till exempel är Histon varianten H2AX fosforyleras av ataxi-telangiektasi muterat (ATM) och andra kinaser följande dubbel-strand breaks (DSB) induktion, och är viktigt för DSB skada signal förstärkning samt att ge en för webbplats för andra faktorer. Fördelningen av skador signalering och reparation väg val verkar påverkas kritiskt av lokala kromatinstruktur på skada platser1. Ett antal kromatin remodeling faktorer, Histon chaperones och Histon ändra enzymer rekryteras verkligen skada platser och är viktiga för effektiv DNA-reparation, belyser betydelsen av kromatin förordning i DDR och reparera2 , 3 , 4. Dessutom skada webbplatsen klustring eller ompositionering observerades i jäst och drosophila5,6,7,8, som påminner om relocalization gen loci i den subnuclear fack associerade med gen förordning9,10. Nyligen genomförda studier i mus och mänskliga celler visade också mobilisering av DSB platser, vilka influenser reparera trohet och väg val11,12. Det väcker möjligheten att DDR och reparera kan även intimt kopplas till nukleära arkitektur, högre ordningens kromatin organisation och kromosom dynamics i cellkärnan. Därför är det avgörande att utveckla högupplösta metoder för att studera DDR och processer i samband med den endogena nukleär miljön i en levande cell reparation för att förstå kort – och långsiktiga konsekvenserna av DNA-skador.

Avgörande roll för PAR-polymeras (PARP) i mäta omfattningen och typen av skada och reglerar Protein montering på webbplatsen skador
PARP1 är en DNA nick sensor snabbt aktiveras av DNA-skador som spelar en avgörande roll i DNA reparation13. PARP1 ursprungligen tänkt att fungera tillsammans med röntgen reparera Cross kompletterar 1 (XRCC1) att underlätta base excision repair (BER), men senare studier avslöja dess roll i andra DNA reparation vägar, däribland DSB reparation14. Aktiverad PARP1 använder nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) som substrat till ADP-ribosylate flera målprotein, inklusive sig själv. Detta enzym och andra familjemedlemmar har uppmärksammats mycket på senare år som PARP-hämmare har uppstått så lovande terapeutiskt läkemedel mot cancer. Även om PARP-hämmare initialt befanns vara effektivt i bröstcancergenen (BRCA)-muterat bröstcancerceller, finns det nu en uppsjö av bevis för deras effekter i mono- och kombination terapi tillsammans med DNA skada agenter/bestrålning mot ett brett spektrum av cancer med mutationer inte begränsat till BRCA15,16,17,18,19,20.

På molekylär nivå visades PARP aktiveringen att spela avgörande roller i att organisera den lokala kromatinstrukturen på skada platser. PAR-beroende rekrytering av kromatin modifiering enzymer underlättar DSB reparation och dikterar reparera väg val, att föreslå viktiga byggnadsställningar roll PAR modifiering vid skada platser. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi nyligen visat uteslutandet av p53-bindande protein 1 (53BP1) från skador platser av PAR 32, att ge en alternativ förklaring för 53BP1-beroende överaktivering av icke-homolog endjoining ( NHEJ) av PARP-hämmare och lyfta fram betydelsen av PARP i DSB reparera väg val33,34. PARP1 också faktorer direkt PARylates och påverkar aktiviteten av flera DNA reparation14.

Använda Laser Microirradiation som ett verktyg för att studera DDR och reparera In Vivo
Laser microirradiation att producera sub micron ändringar på enskilda kromosomer först beskrevs i 196935 och granskas i detalj i 198136. Flera decennier senare, laser microirradiation visades att inducera DNA-skador på en definierad submicrometer region i cellkärnan och visade sig vara en värdefull teknik att studera rekrytering eller ändringar av olika faktorer DNA lesioner i vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denna metod kan upptäcka de faktorer som inte utgör distinkta bestrålning-inducerad foci (IRIF) vid skada platser39,42. Det är också möjligt att undersöka spatiotemporal dynamiken i kromatin strukturella förändringar både på skada platser och i resten av kärnan. Vi jämförde noggrant de Identifieringsdataposter som induceras av olika lasersystem och input befogenheter att utvärdera förhållandet mellan typ av DNA-skador och de microirradiation villkor32,43,44, 45. De avvikande rekrytering mönster av 53BP1 och telomeric upprepa bindande faktor 2 (TRF2) observerades i de tidigare laser skada studier, som utgjorde basen för den återkommande oro för ”icke-fysiologisk” laser-inducerad skada46 ,47,48,49. Vi hittade att dessa uppenbara skillnader nu kunde förklaras av differentiell PARP signalering som mätare mängden och komplexiteten av inducerad skada32. Vi bekräftade att: 1) laser-microirradiated celler (även efter hög input-power bestrålning) grips i interphasen på ett sätt som skador checkpoint kontroll-beroende och förbli lönsamt (åtminstone upp till 48 h)32,50; och 2) reparation faktor rekrytering/ändringar troget sammanfatta dem som observerats med behandling med konventionella DNA skadande agens och DSB induktion av endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Dessa resultat stöder starkt den fysiologiska betydelsen av studera laser skador-inducerad cellulära svar.

Protocol

1. grundläggande Cell förberedelse Obs: Detta steg är för standard immunofluorescens detektion av endogen protein rekrytering eller modifiering och för användning av en cellinje stabilt uttrycker en fluorescently märkta rekombinant protein. Till exempel studie Potorustridactylus (PtK2) pungdjur njure epitelceller stabilt uttrycker andra-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP användes i vår tidigare (figur 1)32. I det förs…

Representative Results

Använder PtK2 celler som stabilt uttrycker andra-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP, utfördes laser ineffekt titreringen för att bestämma den optimala villkoren för deras rekrytering (figur 1)32. Vid platser med hög input-power laser skada den signifikant klustring av CPD (crosslinking skada normalt genereras av ultraviolett (UV) skador) samt GFP-NTH1 DNA glykosylas som uttryckligen erkänner bas skador observerades. Dessutom ob…

Discussion

Fördelarna med att använda laser microirradiation för DDR forskning är:

1. det är möjligt att framkalla olika typer och mängder av DNA skada från enkla strand raster till komplexa DNA-skador, och för att upptäcka olika reparation faktorer på DNA skada platser genom att justera parametrarna laser irradiation. Det är också möjligt att orsaka skada flera gånger i samma cellkärnan för att utvärdera trans effekter (som i figur 3).

<p clas…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Dr Akira Yasui vid Tohoku University, Japan för GFP-NTH1 uttryck plasmiden, och Dr Eros Lazzerini Denchi vid Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien för TRF2-YFP och andra-53BP11220-1711 uttryck plasmider. Detta arbete stöds av av Air Force Office för vetenskaplig forskning (FA9550-04-1-0101) och stiftelsen Beckman Laser Institute Inc. (till M.W.B), de Ford Foundation Fellowship från National Academy of Sciences (till B.A.S), och NSF MCB-1615701 och CRCC CRR-17-426665 (till K. Y.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection
check_url/it/56213?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image