Summary

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Published: August 09, 2017
doi:

Summary

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP) ゼブラフィッシュ胚の神経堤移行の高解像度、リアルタイム三次元画像をキャプチャする実装されました。

Abstract

先天性の目と頭蓋顔面の異常、神経の頂上、全身に様々 な細胞タイプに上昇を与える渡り鳥の幹細胞の一時的な人口の混乱を反映します。神経の頂上の生物学を理解することは、制限、リアルタイムで生体内で調査することができます遺伝的扱いモデルの不足を反映してされています。ゼブラフィッシュは、渡り鳥細胞群、神経堤などを勉強するため特に重要な発達モデルです。Sox10foxd3初期神経分化と神経堤細胞のマーカーを表す可能性があります多数の動物モデルで示されている、発展途上の目に神経の頂上の移行を検討するには、長波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせはトランスジェニックゼブラフィッシュ胚で、Tg (sox10:EGFP) と Tg (foxd3:GFP)、すなわち開発の目の高解像度、立体化、リアルタイムのビデオをキャプチャする実装されました。多光子タイムラプス イメージングは、動作や目の早期開発に貢献する 2 つの神経堤細胞集団の移住性パターンを識別する使用されました。このプロトコルは、例としてゼブラフィッシュ神経堤移行中に時間経過のビデオを生成するための情報を提供し、ゼブラフィッシュと他のモデル有機体の多くの構造の初期の開発を視覚化するさらに適用することができます。

Introduction

先天性眼疾患小児失明を引き起こすことができるおよび頭蓋神経堤の異常によることが多い。神経堤細胞は神経管から発生し、全身の多くの組織を形成する非定常の幹細胞です。1,2,3,4,5前と、中脳由来神経堤細胞は、骨と軟骨の顔面と前頭葉、虹彩、角膜、小柱網と目の眼の強膜に上昇を与えます。4,6,7,8神経堤細胞、咽頭アーチ菱フォーム、あご及び心臓流出路から。1,3,4,9,10研究を強調しますしている眼に神経の頂上の貢献や眼周囲の開発、脊椎動物の目の開発のこれらのセルの重要性を強調します。確かに、神経堤細胞の移動と分化の混乱は、Axenfeld リーガー症候群および Peters プラス症候群における顎顔面と眼球の異常に します。11,12,13,14,15,16,17したがって、これら神経堤細胞の分化、増殖、移行の包括的な理解は、先天性眼疾患の基になる複雑さに洞察を提供します。

ゼブラフィッシュはゼブラフィッシュ眼の構造は、哺乳類に類似し、多くの遺伝子は、ゼブラフィッシュと哺乳類の間保存された眼の開発を研究するため強力なモデル生物です。18,19,20また、zebrafish の胚が透明で、卵生、目におけるリアルタイムの可視化を促進します。

以前に発行された仕事で拡大して、67,20神経堤細胞の移動パターン多光子蛍光タイムラプス イメージング (性決定領域 Y) sry 遺伝子の転写制御の下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) の付いたトランスジェニックゼブラフィッシュ線を使用して記述された-ボックス 10 (sox10) またはフォーク ヘッド ボックス D3 (foxd3) 遺伝子の規定する領域。21,22,23,24. 多光子蛍光タイムラプス イメージングはレーザ走査型顕微鏡標本 fluorophores が付いているタグの立体化、高解像度の画像をキャプチャする長い波長多光子蛍光励起の高度な光学技術を組み合わせた強力な手法です。25,26,27多光子レーザーの使用増加組織浸透と減少蛍光漂白などを含む標準の共焦点顕微鏡上の明確な利点があります。

このメソッドを使用すると、移行と渡り鳥の経路のタイミングでさまざまな神経堤細胞の 2 つの異なる集団が眼周囲間充織と発展途上の目で判別、すなわち foxd3 陽性の神経堤細胞と顔面の間充織で sox10 陽性神経堤細胞。この方法では、開発中にリアルタイムで規制の神経堤の移行を観察しやすくゼブラフィッシュ眼と顔面神経の頂上の移行の移行を可視化へのアプローチは導入されました。

このプロトコルは、Tg (sox10:EGFP) の例として、Tg (foxd3:GFP) 遺伝子導入ゼブラフィッシュ初期の目の開発の間に時間経過のビデオを生成するための情報を提供します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ神経堤細胞由来眼と顔面の構造体の早い開発の高解像度、リアルタイム 3次元可視化のためさらに適用できます。また、このメソッドは、他の組織や臓器ゼブラフィッシュと他の動物モデルの開発の可視化のためさらに適用できます。

Protocol

The protocol described here was performed in accordance with the guidelines for the humane treatment of laboratory animals established by the University of Michigan Committee on the Use and Care of Animals (UCUCA). 1. Embryo Collection for Time-lapse Imaging Between 3 and 9 pm, set up male and female adult Tg(sox10:EGFP) or Tg(foxd3:GFP) transgenic zebrafish in a divided breeding tank for pairwise mating. NOTE: The Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:G…

Representative Results

多光子蛍光タイムラプス イメージングは、ゼブラフィッシュ行 craniofacial 構造と Tg (sox10:EGFP) と Tg (foxd3:GFP) の眼の前眼部に上昇を与える頭部神経堤細胞の移行パターンを明らかにしたビデオのシリーズを生成されます。例としてsox1012 と 30 の hpf の間肯定的な神経堤細胞は神経管の端から顎顔面領域 (ビデオ 1 図 2</strong…

Discussion

多光子タイムラプス イメージングが一過性と渡り鳥の細胞集団の生体内で追跡を可能にします。リアルタイムで萌芽期のプロセスを研究するこの強力な技術を使用ことができます、現在の研究では、このメソッドの結果は神経堤細胞の移動と開発の現在の知識を強化します。以前のタイムラプス イメージング研究は、通常、共焦点レーザ走査型顕微鏡を利用します。29</s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、トーマス ・ シリングが親切贈与 Tg (sox10:eGFP) 魚とメアリー halloran さん親切贈与 Tg(foxd3:GFP)魚をありがちましょう。

Materials

Breeding Tanks with Dividers Aquaneering ZHCT100 Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert
M205 FA Combi-Scope Leica Microsystems CMS GmbH Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam
Sodium Chloride Millipore (EMD) 7760-5KG Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3
Potassium Chloride Millipore (EMD) 1049380500 Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8.
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500 Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8
Magnesium Sulfate (Anhydrous) Millipore (EMD) MX0075-1 Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2
Methylene Blue Millipore (EMD) 284-12 Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain
Sodium Bicarbonate Millipore (EMD) SX0320-1 Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8
N-Phenylthiourea Sigma P7629-25G >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2
Dimethylsulfoxide Sigma D8418-500ML Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3
Tricaine Methanesulfonate Western Chemical Inc. MS222 Tricaine-S
Low-Melt Agarose ISC Bioexpress E-3112-25 GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g
Open Bath Chamber Warner Instruments RC-40HP High Profile
Glass Coverslips Fisher Scientific 12-545-102 Circle cover glass. 25 mm diameter
High Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5C 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION
1658832
Quick Exchange Platform Warner Instruments QE-1 35 mm
Stage Adapter Warner Instruments SA-20LZ-AL 16.5 x 10 cm
TC SP5 MP multi-photon microscope Leica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser SpectraPhysics
Laser Safety Box Leica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  Software Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software Adobe
iMovie Version 10.1.4 Software Apple

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Citazione di questo articolo
Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56214, doi:10.3791/56214 (2017).

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