Vi rapporterar protokollen för syntesen och rening av peptid nukleinsyra (PNA) oligomerer införliva ändrades rester. De biokemiska och biofysikaliska metoderna för karakterisering av erkännande av RNA duplex av de modifierade PNAs beskrivs.
RNAs växer fram som viktiga biomarkörer och terapeutiska mål. Således finns det stor potential i att utveckla kemiska sonder och terapeutiska ligander för erkännande av RNA-sekvens och struktur. Kemiskt modifierade peptid nukleinsyra (PNA) oligomerer har nyligen framtagits som kan känna igen RNA duplex i en sekvens-specifika sätt. PNAs är kemiskt stabila med en neutral peptid-liknande ryggrad. PNAs kan syntetiseras relativt enkelt av den manuella Boc-kemi fasta fas peptid syntes metoden. PNAs renas genom HPLC med omvänd fas, följt av molekylvikt karakterisering av matrix-assisted laser desorption och jonisering-tid för flygning (MALDI-TOF). Icke-denatureringen Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan) teknik underlättar bildtagning av triplex-formationen, eftersom noggrant utformade gratis RNA duplex konstruerar och PNA bunden etage ofta visa olika migration priser. Icke-denatureringen sida med etidiumbromid bromid post färgning är ofta en enkel och informativ teknik för att karaktärisera den bindande samhörighet och särdrag av PNA oligomerer. Vanligtvis kan flera RNA hårnålar eller etagevåningar med enda baspar mutationer användas att karakterisera PNA bindande egenskaper, till exempel bindande samhörighet och särdrag. 2-Aminopurine är en isomer av adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescensintensiteten är känslig för närmiljön strukturella förändringar, och är lämplig för övervakning av triplex bildandet med 2-aminopurine återstoden införlivas nära PNA bindningsstället. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan också användas för att bekräfta bindande selektivitet modifierade PNAs mot riktade dubbelsträngat RNA (dsRNAs) över enkelsträngat RNA (ssRNAs). UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur experiment tillåta mätning av termisk stabilitet PNA-RNA duplex och PNA· RNA2 etage. Här beskriver vi syntesen och rening av PNA oligomerer införliva ändras rester och beskriva biokemiska och biofysikaliska metoder för karakterisering av erkännande av RNA duplex av de modifierade PNAs.
RNAs växer fram som viktiga biomarkörer och terapeutiska mål, på grund av de senaste framstegen inom upptäckter av RNASEN roller i förordningen och katalys av olika biologiska processer1,2,3. Traditionellt, har antisense trådar använts för att binda till ssRNAs till Watson-Crick duplex bildandet3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. nyligen, triplex-bilda peptid nukleinsyror (TFPNAs) har utformats för att binda till dsRNAs via Hoogsteen vätebindningen (figur 1)3,28,29. dsRNA regioner är närvarande i flesta traditionella antisense-riktade RNASEN, inklusive pre-mRNA och mRNA, före eller pri-MicroRNA3, och många andra icke-kodande RNAs1,26,27. Inriktning dsRNAs genom Trippel helix formation med hjälp av TFPNAs kan vara fördelaktigt på grund av dess struktur särart och är av stor potential för användning i att återställa normala funktioner av RNASEN, som är dysreglerad i sjukdomar, till exempel.
Den nyligen publicerade arbete av Rozners et al., och oss3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterade ansträngningar på att förbättra selektiva bindningen av modifierade TFPNAs mot dsRNAs med förbättrad affinitet. Vi har utvecklat syntesmetoder för rationellt designade PNA monomerer (figur 2) inklusive thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 och guanidin-modifierad 5-metyl cytosin (Q) monomer31. Genom olika biokemiska och biofysiska karakterisering metoder, har vi visat att relativt kort PNAs (6-10 rester) införliva L och Q rester visar förbättrad erkännande av Watson-Crick G-C och C-G baspar, respektive i dsRNAs. Jämfört med oförändrad PNAs, visar PNAs innehållande L och Q rester dessutom mer selektiv bindning mot dsRNA över ssRNA och dsDNA. De guanidin funktionalitet42 i Q basen gör PNAs ange HeLa celler31.
I vårt laboratorium, vi syntetisera PNAs av manuell Boc-kemi (Boc eller t– Boc står för tert-butyloxycarbony (se figur 2) fasta fasen peptid syntes metod4. Syntesen av PNA monomeren med Boc som den aminen skydda gruppen är bekvämt eftersom gruppen Boc är koalisera mindre skrymmande jämfört med fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine skydda gruppen, vilket kan vara fördelaktigt under PNA monomer koppling den fast stöd. Boc gruppen är syra-labila och kan lätt avlägsnas med massivt stöd av 20-50% trifluorättiksyra (TFA) i diklormetan (DCM) under PNA syntes. En automatiserad peptid synthesizer kan användas för att syntetisera PNA oligomerer; 3-5-faldigt överskott av PNA monomer behövs dock för en automatiserad peptid synthesizer. Manuell syntes kräver betydligt mindre PNA monomer (2-3-faldigt överskott), med varje koppling enkelt övervakas av den Kaiser test43. Dessutom är många automatiserade syntar inte kompatibla med Boc strategi syntesen av användning av frätande TFA under Boc borttagning steg.
De PNA oligomererna kan renas genom omvänd-fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC) följt av molekylvikt karakterisering av MALDI-TOF (figurerna 3 och 4)30, 31. vi anställa icke-denatureringen sida att övervaka triplex bildandet, på grund av att gratis RNA duplex konstruerar och PNA bunden etage ofta visa olika migration priser (figur 5)30,31 . Ingen märkning behövs om effektiv efter färgning kan uppnås för båda av RNA duplex och PNA· RNA2 triplex band. En relativt liten mängd prov behövs för icke-denatureringen sidan experiment. Lastning (inkubation) buffertar och rinnande buffertar (pH 8,3) kan dock inte samma, vilket resulterar i mätningarna att vara begränsade till de kinetiskt stabila etage, eftersom ett relativt högt pH-värde på 8,3 avsevärt kan destabilisera en triplex.
2-Aminopurine är en isomer av adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescensintensiteten (med ett utsläpp peak på cirka 370 nm) är känslig för närmiljön strukturella förändringar, och är lämplig för övervakning av triplex formation med 2-aminopurine återstoden införlivas nära PNA bindande webbplats () Figur 6) 31. till skillnad från många andra färgämnen som visar fluorescens utsläpp i det synliga området, 2-aminopurine-märkt RNA kan utsättas för rummet ljus utan foto blekning. Till skillnad från sidan experiment där en rinnande buffert pH 8,3 behövs ofta, 2-aminopurine baserat fluorescens titrering tillåter mätning av bindande i en lösning vid angivna pH och därmed kan tillåta mätning och detektering av relativt svaga och kinetiskt instabil bindande vid jämvikt.
UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur experiment tillåta mätning av termisk stabilitet duplex (figur 7)31 och triPlex30,32,44,45. Beroende på längd och sekvens sammansättning, smältning av etage kan eller inte kan visa en tydlig övergång. Termodynamiska parametrar kan erhållas om värme- och kylsystem kurvorna överlappar varandra. Korrekt termodynamiska parametrar kan erhållas genom isotermiska titrering calorimetry (ITC)32; dock krävs relativt stora mängder prover generellt för ITC.
RNA duplex-bindande PNA oligomerer (t.ex., 10-mers) är medelstora molekyler och därmed kan visa elektroforetiska mobilitet Skift vid bindning till RNAs med en jämförbar eller något större storlek (t.ex., 50-mer eller mindre). Om en RNA är betydligt större än PNA, kanske titrering av PNA i RNA inte fungerar på grund av en begränsad gel rörlighet SKIFT. Således, den stora RNA trunkeras för de icke-denatureringen sida analyserna. Titrering av en stor RNA in en fluorophore-märkt PNA möjliggör övervakning av triplex bildandet av en icke-denatureringen agarosgel med provet laddade mitt gel40.
För ett experiment med titrering av icke-denaturering med en konstant koncentration av RNA använder vi vanligtvis en omärkt RNA-koncentrationen av 1 µM för effektiv post färgning av gratis RNA och triplex band av etidiumbromid. En RNA-koncentrationen så låga som 0,2 µM kan också vara tillräckligt beroende på RNA konstruera31. Koncentrationen av omärkta RNA (0,2 µM) avgör att Kd värdena som kan mätas exakt bör vara om 0,2 µM eller större. Andra färgning färgämnen kan användas för att effektivisera färgning. Alternativt tyder våra opublicerade data på att Cy3 dye-märkt RNAs kan användas i icke-denatureringen sidan experiment för att mäta trånga bindande händelserna.
På grund av att 2-aminopurine är endast måttligt fluorescerande, är 2-aminopurine fluorescens titrering också begränsad till mätningen av bindningen med Kd -värden nära eller över 0,2 µM31. RNA eller PNA kan märkas med en relativt ljus färgämne för att kvantifiera en relativt snäva bindande lösning genom fluorescens titrering, om bindningen resulterar i förändringar i fluorescens signaler53,54, 55.
Strategin med inriktning RNA strukturer av dsRNA-bindande PNAs har testats för ett begränsat antal RNAs. Det är troligt att bindande egenskaper kan variera för dsRNAs med olika sekvenser och baspar kompositioner. Man kan alltid välja purine-rika strand med en duplex för utformningen av TFPNAs. Det är viktigt att förstå hur raka Q· C-G tripplar kan påverka stabiliteten i en triplex. Mer omfattande sekvens-beroende studier tydligt behövs för att förstå sekvens-beroende bindande egenskaper för TFPNAs.
Affinitet för TFPNAs kan förbättras ytterligare genom att öka längden och/eller ytterligare modifiera de baser och ryggrader56,57 i TFPNAs. Dock kan en kontinuerlig duplex region inte ofta bestå av mer än 10 konsekutiva baspar utan störningar av icke-Watson-Crick strukturer. Man kan böja TFPNAs med små molekyler för erkännande av icke-Watson-Crick strukturer intill dsRNA regioner. I princip förväntas ett TFPNA-liten molekyl konjugat ha bättre affinitet och specificitet jämfört med en TFPNA eller liten molekyl ensam. Dock de kemiska och fysikaliska egenskaperna av länkaren för de konjugation58,59,60,61,62,63,64 måste optimeras.
Det faktum att TFPNAs kan selektivt binder till dsRNAs över ssRNAs och dsDNAs tyder på att det är möjligt att utveckla TFPNAs som mycket användbar kemisk sonder och potentiella terapeutiska ligander genom reglering av RNA strukturdynamik och interaktioner med proteiner och metaboliter. Cellernas upptag av TFPNAs kan underlättas genom konjugationen med cell-penetrerande beståndsdelarna som små molekyler, peptider, och nanopartiklar eller komplexbildning med supramolekylär strukturer såsom liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Funktionalisering av TFPNAs med bioimaging taggar såsom fluorophores och radioisotoper kan ytterligare underlätta upptäckten, imaging och målinrikta funktionella RNA strukturer i levande organismer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Singapore ministeriet för utbildning (MOE) Tier 1 (RGT3/13 och RG42/15 att G.C.) och MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 och MOE2015-T2-1-028 att G.C.).
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets | Alfa Aesar | 87956 | |
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) | Sigma-Aldrich | 532444 | |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Alfa Aesar | A11801 | |
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) | Alfa Aesar | B25251 | |
Acetic anhyride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
Kaiser Test Kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | |
Unmodified PNA monomers | ASM Research Chemicals GmbH | 5004007, 5004008, 5004009, 5004010 | |
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH | Sigma-Aldrich | B8389 / 47624 | |
Thioanisole | Alfa Aesar | A14846 | |
1,2-Ethanedithiol | Alfa Aesar | L12865 | |
Trifluoromethanesulfonic acid | Alfa Aesar | A10173 | |
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 | Merck Millipore | 150838 | |
RNA Oligos | Sigma-Aldrich | Customized | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | 39468 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Alfa Aesar | J15694 | |
HEPES | Lonza | 17-737E | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A8887 | |
N.N'-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-rad | 161-0700 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-rad | 161-0800 | |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 | 1st Base | BUF-3010-10X1L | |
Glycerol | Promega | H5433 | |
Ethidium bromide (10 mg/mL) | Bio-rad | 161-0433 | |
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) | Hellma Analytics | 105.250-QS |